Fatigue chronique, douleurs articulaires

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1 Fatigue chronique, douleurs articulaires
Hémochromatose Excès d ’absorption du fer au niveau duodénal et accumulation dans les organes parenchymateux Fatigue chronique, douleurs articulaires Retentissement sur trois organes principaux : le foie : hépatomégalie, cirrhose, hépatocarcinome le pancréas : diabète le cœur : tachycardie, cardiomégalie Traitement efficace (soustractions sanguines) si débuté avant l’installation de complications irréversibles  importance du diagnostic précoce

2 Hétérogénéité génétique
Forme transmission gène impliqué localisation protéine Type AR HJV 1q hémojuvéline (juvénile) AR HAMP q hepcidine Type AR TFR q récepteur 2 de la transferrine Type AD SLC40A q ferroportine Type AR HFE p HFE

3 Hémochromatose génétique de type 1 (HFE) : maladie fréquente ou rare ?
≈ 3/1000 homozygotes C282Y mais pénétrance < 10% Facteurs liés à l’hôte Gènes modificateurs

4 Fer intrahépatique (mg/g poids sec)
3000 2000 Fer intrahépatique (mg/g poids sec) WT Hfe -/- 1000 B6 (C57BL/6) D2 (DBA/2) Des gènes modificateurs modulent l’accumulation du fer intrahépatique chez les souris Hfe -/-

5 Distance moyenne entre les recombinaisons d’environ 30 cM
Intercross F2 B6 Hfe -/- D2 Hfe -/- X X F1 Hfe -/- F2 Hfe -/- Distance moyenne entre les recombinaisons d’environ 30 cM

6 Fer intrahépatique (mg/g poids sec)
D2 Hfe -/- B6 Hfe -/- F1 Hfe -/- 1000 F2 Hfe -/-

7 Criblage du génome sur des animaux F2 obtenus
à partir du croisement entre souris B6 et D2 Hfe -/- > génotypes sur la plate-forme Génomique (Génopole de Toulouse)

8 Marqueurs microsatellites
Séquence répétée (ex : CA) Régions flanquantes uniques Le nombre de répétitions est très variable entre individus (ici entre souches) B6 D2

9 Marqueurs microsatellites

10 Marqueurs microsatellites

11 Liaison suggestive avec 5 autres régions
Liaison significative avec 5 régions sur les chromosomes 3, 7, 8, 11 and 12 Liaison suggestive avec 5 autres régions FOIE

12 Liaison significative avec une région sur le chromosome 11
Liaison suggestive avec 4 autres régions RATE

13 89 lignées BXD génotypées pour 13 370 SNPs
Utilisation de lignées recombinantes consanguines BXD pour réduire les régions candidates B6 X D2 F1 X X X X F2 89 lignées BXD génotypées pour SNPs

14 Utilisation de lignées recombinantes consanguines BXD pour réduire les régions candidates
44 cM on chr 3 15 cM on chr 7 28 cM on chr 8 64 cM on chr 11 40 cM on chr 12 BXD 9 BXD 21 BXD 33 Ces trois lignées consanguines BXD présentent toutes une recombinaison dans au moins une des régions d’intérêt B6 D2

15 Tests de ségrégation D2 Hfe-/- BXD Hfe+/+ B6 Hfe-/- X X F1 Hfe+/-
Corrélation génotype / fer intrahépatique Pas de corrélation Corrélation génotype / fer intrahépatique Pas de corrélation

16 Système BeadXpress (Illumina)
Génotypage des descendants des 3 lignées (BXD9, 21 et 33) pour un jeu de 96 SNPs

17 Tests de ségrégation pour la lignée BXD33 et la région candidate sur le chromosome 7
Hfe+/+ BXD33 B6 (F2 Hfe-/-) BXD33 D2 F2 Hfe-/- BXD33 B6 BXD33 D2 BB BD DD Corrélation génotype / fer intrahépatique (ANOVA; p<0.0001) 1000 1500 2000 2500 BB BD DD Pas de corrélation génotype / fer intrahépatique (ANOVA; p=0.93) 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

18 2 gènes candidats : Hamp1 et Hamp2
Hep1 T N P I F C K S Q D G B6 D2 Hep2 I N P F C R Q K S E D G B6 D2 variants influençant la structure vs. variants influençant le niveau d’expression d’un transcrit?

19 2 gènes candidats : Hamp1 et Hamp2
20 19 18 17 16 B6 log2(expression génique) 15 D2 14 13 12 11 10 Hamp1 Hamp2

20 7900 HT Real-Time PCR System (Applied Biosystems)
L’expression de Hamp2 a été mesurée chez 78 souris (B6 x D2) F2 Hfe -/- 7900 HT Real-Time PCR System (Applied Biosystems) LightCycler 480 (Roche)

21 L’expression de Hamp2 dans le foie est régulée en cis
L’expression de Hamp2 a été mesurée chez 78 souris (B6 x D2) F2 Hfe -/- Hamp2 cis-eQTL Position du gène Hamp2 L’expression de Hamp2 dans le foie est régulée en cis

22 L’allèle B6 au locus Hamp2 est associé à une faible expression du messager Hamp2 et à une forte concentration en fer intrahépatique

23 -208 -194 GTGACACAACCCTGT GTGGCACAACCCTGT Hamp1 B6 D2 B6 Hamp2 D2 TGF-b inducible early gene (TIEG) responsive element

24 120 souris (B6 x D2) F2 Hfe -/- 120 ADNs 120 ARNs extraits du foie
192 SNP génotypés par souris à l’aide du système BeadXpress (Illumina) 120 ARNs extraits du foie 120 ARNs extraits de la rate 88 K mesures d’expression par souris, obtenues à l’aide de puces à ADN Agilent 4x44K tours de génome pour identifier les gènes régulés en cis dans le foie et/ou la rate

25 Recherche de corrélations Co-localisation génomique
F2 intercross (120 souris F2 Hfe -/-) Traits quantitatifs cliniques (fer dans le sérum, le foie, la rate…) Niveaux d’expression génique (44,000 transcrits dans le foie et la rate) Recherche de QTLs Recherche de corrélations Recherche de QTLs cQTL eQTL Co-localisation génomique Gènes modificateurs potentiels, à valider

26 Régulation du métabolisme du fer
4500 4000 3500 3000 Fer dans le foie (mg/g de poids sec) 2500 B6 2000 D2 1500 1000 500 C N R Alimentation Puces Agilent 4x44 K 25 20 Log2(gene expression) 15 10 5 C N R C N R Hamp1 Hamp2

27 C N R C N R Bmp6 Smad7 C N R C N R Id1 Atoh8 B6 D2
13 12 11 B6 Log2(gene expression) 10 D2 9 8 7 6 C N R C N R Bmp6 Smad7 14 13 12 Log2(gene expression) 11 10 9 8 7 6 C N R C N R Id1 Atoh8

28 HJV BMP6 ? BMPR-I TFR2 HFE BMPR-II Smad1/5/8 Smad7 Smad4 HEPATOCYTE
Membrane plasmique TFR2 HFE BMPR-II Smad1/5/8 P Smad7 P P Smad4 HEPATOCYTE Id1 Hepcidine ID1 HAMP Noyau

29 Aude Saint Pierre Maria Martinez Hélène Coppin MPR Patricia Martinez Olivier Rouquet Léon Kautz Valérie Darnaud Delphine Meynard Flavie Desneulin