DÉROULEMENT DE LA PRODUCTION DES HYBRIDOMES

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1 DÉROULEMENT DE LA PRODUCTION DES HYBRIDOMES
SELECTION DES HYBRIDOMES TEST DES HYBRIDOMES FUSION DES CELLULES Ertet PRODUCTION DES HYBRIDOMES ISOLEMENT DES HYBRIDOMES OBTENTION DES CELLULES

2 OBTENTION DES CELLULES
+ FUSION IMMUNISATION DE LA SOURIS AVEC L’ANTIGÈNE ÉTUDIÉ OBTENTION DES LYMPHOCYTES SPECIFIQUES OBTENTION DES CELLULES UTILISATION DE CELLULES MYELOMATEUSES HGPRT- OBTENTION DES CELLULES IMMORTELLES

3 + Par méthode chimique Par méthode physique FUSION DES CELLULES
SELECTION Par méthode chimique FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES AVEC DU PEG (poly éthylène glycol) FUSION DES CELLULES Par méthode physique FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES PAR ELECTROPORATION

4 SELECTION DES HYBRIDOMES
+ SELECTION DES HYBRIDOMES Culture sur milieu HAT Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine ISOLEMENT Cellule myélomateuse HGPRT- Lymphocyte B MORT CELLULAIRE Impossibilité de se diviser HYBRIDOME SELECTIONNE MORT CELLULAIRE disparition aprés quelques divisions

5 ISOLEMENT DES HYBRIDOMES
+ ISOLEMENT DES HYBRIDOMES Dès que la croissance est suffisante, il faut propager les cultures d'hybridomes productrices de l'anticorps désiré (transferts des puits de 0,3 à 2 ml, puis à des bouteilles de 25 ml), les conserver et les cloner. Deux méthodes sont utilisées pour obtenir un clone à partir d'une cellule : TEST Sur milieu gélosé Par dilution limite Une colonie = une cellule initiale Une ou zéro cellules par puit

6 + TEST DES HYBRIDOMES TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUIT
PRODUCTION TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUIT DE LA PRESENCE DES ANTICORPS MONOCLONAUX PAR LA METHODE ELISA DU TYPE D’ANTICORPS PRODUIT PAR DES METHODES D’IMMUNOPRECIPITATION

7 + ELISA PRODUCTION TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUIT DE LA PRESENCE DES ANTICORPS MONOCLONAUX PAR LA METHODE ELISA

8 ANTICORPS MONOCLONAUX
+ PRODUCTION DES ACM Production par cultures cellulaires Amplification des hybridomes OBTENTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX Production dans les liquides d'ascites CONSERVATION DES HYBRIDOMES

9 Milieu HAT : Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine
AMP HGPRT Hypoxanthine IMP Azasérine GMP Aminoptérine Synthése endogène Aminoptérine Thymidine TMP Thymidine Kinase Milieu HAT : Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine Milieu Haza : Hypoxanthine, azasérine

10 L'obtention d'anticorps purs en quantité suffisante (milligrammes) permet :
- de caractériser les antigénes étudiés et de mettre au point des dosages radioimmunologiques ; - le couplage d'anticorps monoclonaux sur Sepharose. - le couplage des anticorps monoclonaux sur plastique. Des séparations et purifications cellulaires (méthode dite de « paning ») ont ainsi éte réalisées, comme par exemple la séparation des lymphocytes B et T humains ou celle de certaines populations cellulaires dérivant de la moelle. La production d'anticorps contre des antigénes de différenciation cellulaire ou contre des antigènes présents sur de faibles fractions de populations cellulaires. C'est par exemple le cas des marqueurs de sous-populations de lymphocytes T ou de cellules nerveuses.

11 LES CELLULES DE MYELOME
Les cellules de myélome, les plus couramment utilisées, sont celles de la souche de souris Balb/c. Cultiver les cellules murines dans un milieu MEM Dulbecco contenant % de sérum de veau et 4,5 g/l de glucose. Incuber les cellules à 37°C dans une atmosphère enrichie en C02 (5-10 %), avec une inoculation de cellules/ml. Maintenir les cellules en culture à des densités de à cellules/ml. Pour la fusion, les cellules de myélome doivent être en phase logarithmique et le taux de cellules vivantes doit être supérieur à 98 %. Sur des lignées mises en culture depuis au moins une semaine, déterminer le taux de survie par un test de viabilité au bleu trypan. Contrôler la mutation HGRT par addition de 20 µg/m d'azaguanine.

12 LES LYMPHOCYTES : IMMUNISATION DE L’ANIMAL
Habituellement, on utilise la même lignée d'animaux que celle employée pour l'obtention des cellules myélomes. La souche de souris Balb/c est donc appropriée, d'autant plus qu'elle se révèle excellente pour la production ultérieure in vivo des hybridomes. Mélanger l'antigène choisi en émulsion avec un adjuvant qui stimule le système immunitaire. L'adjuvant de Freund peut par exemple être utilisé : il s'agit d'une suspension de mycobactéries inactivées. L’injecter sous la peau ou dans la cavité péritonéale de l'animal. La plus grande attention doit être apportée, afin que l'expérimentateur ne s'injecte pas l ’adjuvant, ce qui provoquerait des complications immunitaires longues (arthrite). Répéter plusieurs fois ce processus à un intervalle de 3-4 semaines ; ainsi les lymphocytes B qui réagissent à l'antigène choisi sont chaque fois plus fortement stimulés. La dernière injection se fait par voie intraveineuse. Cette introduction dans le sang d'une forte dose d'antigène induit une prolifération intense des cellules stimulées, après environ 3 jours.

13 ISOLEMENT DES LYMPHOCYTES
Après 3 jours tuer l'animal et extraire sa rate sous condition stérile. Broyer ensuite cet organe et mettre les cellules en suspension dans un milieu dépourvu de sérum. Ces cellules sont transférées dans un tube à centrifugation contenant 3 ml de lymphoprep. Les lymphocytes sont séparés des globules rouges et du liquide de la rate par centrifugation sur gradient de densité. Centrifuger à 400 g pendant 30 minutes. Récupérer les lymphocytes à l'interface et les laver avec du PBS (centrifugation 10 minutes à 100 g). Reprendre le culot cellulaire avec 2 ml de PBS. Homogénéiser doucement avec une pipette. Quand la suspension est homogène réaliser un test de viabilité au bleu Trypan suivi d'un comptage à l'hématimètre On obtient à cellules par rate de souris. Le taux de survie est déterminé par coloration au bleu trypan ou par fluorescence.

14 FUSION AVEC PEG Ces lymphocytes servent directement à la fusion avec les cellules myélomes, en phase exponentielle. Laver les cellules du myélome dans un tampon car la fusion s'opère difficilement en présence de protéines sériques Préparer les suspensions cellulaires pour avoir une proportion de 5 à 1. Les mélanger. Rajouter 1 ml de PEG concentré à 50 % dans 40 ml de mélange cellulaire. Le traitement de fusion ne doit pas durer longtemps (au maximum quelques minutes), car le PEG est cytotoxique. Quant le PEG est ajouté aux cellules et délicatement mélangé, des agrégats cellulaires se forment, ce qui indique que les membranes cellulaires sont en voie de fusion. Eliminer le PEG par centrifugation et laver les cellules. Ces dernières sont diluées avec des milieux de culture et distribuées à raison de 1 ml dans chaque puits de plaques de microtitration.

15 ELECTROFUSION La fusion des cellules, à l'aide d'un champ électrique, nécessite un appareillage assez coûteux, mais offre l'avantage d'une augmentation à la fois des taux de fusion (1:10 au lieu de 1 : 104) et du nombre de cellules hybrides stables. Une majorité des hybrides provient de la fusion de deux cellules et non de plusieurs, comme c'est le cas avec le PEG. Le processus de fusion peut être observé au microscope. Ce procédé se réalise en deux étapes. Mettre les cellules à fusionner en suspension dans un milieu à faible conductibilité. Celui ci est obtenu par mise dans un champ électrique alternatif d'une amplitude de 250 V/cm et à une fréquence de 1,5 MHz. Les cellules, en migrant dans ce champ électrique, forment des chaînettes de plusieurs cellules en établissant le contact membranaire entre les cellules à fusionner. Faire subir un choc électrique de forte intensité (3.5 KV/cm) pendant trois fois 15 µs. On provoque ainsi des perforations réversibles des membranes cellulaires dans les zones de contact ce qui entraîne la fusion des cellules.

16 SÉLECTION DES HYBRIDOMES
Les cellules obtenues après traitement fusogène sont mises en suspension dans un milieu de croissance et cultivées dans des puits. Le premier travail va être de sélectionner les seules cellules hybrides. Après 24 heures, ajouter une solution de HAT (hypoxanthine, aminoptérine, thymidine) dans le milieu de croissance. Dans ce milieu sélectif, seuls les hybrides lymphocytes (HGPRT+) / cellules myélomes (HGPRT-) survivent, grâce à l'hypoxanthine et à la thymidine fournies par le milieu HAT. Après deux semaines, éliminer progressivement le milieu HAT. On considère que les seules cellules encore capables de se multiplier ont stabilisé leur résistance au HAT et sont obligatoirement des hybrides. On permet alors aux hybrides d'utiliser de nouveau la voie endogène de synthèse des nucléotides.

17 SÉLECTION DES HYBRIDOMES PRODUCTEURS
Le second travail de sélection consistera à détecter les hybrides sécrétant des anticorps à spécificité définie. Ces tests doivent être sensibles (environ 10-8 g d'anticorps/ml), reproductibles et réalisables rapidement en grand nombre. Il faut éviter la saturation des puits de culture ou leur envahissement par des hybrides non sécréteurs. Mettre l'antigène en solution dans un tampon et le distribuer dans des plaques de microtitration en chlorure de polyvinyle. Les protéines adhérent de façon non spécifique au chlorure de polyvinyle (PVC). Si une molécule porteuse a été utilisée pour l'immunisation, il faut en utiliser une différente pour coupler le peptide et changer d'agent couplant. Bloquer les autres sites libres à la surface du plastique par addition d'albumine ou d'autres protéines ajoutées en concentration saturante. Ajouter dans ces puits un aliquot des surnageants des cultures d'hybridomes contenant les anticorps. Incuber environ 60 minutes pour permettre à l'anticorps de se fixer à l'antigène immobilisé. Laver les puits avec un tampon.

18 SÉLECTION DES HYBRIDOMES PRODUCTEURS
De nombreux procédés sont maintenant utilisables : test radioimmunologique (RIA), révélations immunoenzymatiques (ELISA), immunofluorescence, cytotoxicité, immunocytologie, etc. .... Ajouter le réactif révélateur. Ce réactif est soit un anticorps antimurin (produit par une espèce différente de l espèce souris) soit la protéine A bactérienne qui a une excellente affinité pour de nombreuses immunoglobulines. Ces molécules sont marquées par un radioisotope, un fluorochrome ou une enzyme. Suivant le type de révélateur effectuer la lecture des puits à l ’œil nu ou avec un appareil de mesure ( compteur à scintillation ou spectrofluorimètre). Le couplage se fait le plus souvent avec de l'iode marquée (I126), avec un composé chimiluminescent (dérivés du luminol) ou avec une enzyme telle que la peroxydase, la phosphatase alcaline ou la b-galactosidase. Cette dernière méthode est dénommée ELISA (enzyme-linked-immunoabsorbent-assay).

19 CLONAGE EN MILIEU GÉLOSÉ
Le clonage des cellules s ’effectue en milieu semi-solide préparé avec une gélose se solidifiant à 32°C. Les colonies formées sont transférées en milieu liquide dans des puits. Le milieu se présente sous forme de deux couches de bacto-agar de 0.5% et 0.3% autoclavé et coulé dans des boites de culture de 5 cm de diamétre. L’agar aura été préparé avec du milieu HAT.  Couler la première couche d’agar à 0.5% dans la boite de culture en diluant une solution stock à 5% avec le milieu HAT ( 5 ml par boite).  Préparer des aliquots de 5 ml d’agar à 0.3% et les laisser en surfusion à 44 °C. Juste avant de couler la couche supérieure, rajouter 10 µl des hybridomes à cellules/ml. Préparer trois boites de chaque dilution.  Transférer les boites dans l ’incubateur à CO2 (5%) en s ’assurant que l’atmosphère est suffisamment humide. Laisser 10 à 14 jours dans l ’incubateur.  Au bout de 14 jours, transférer les colonies apparues dans des plaques de microtitration et les tester pour l ’activité anticorps.

20 CLONAGE PAR DILUTION LIMITE
A une dilution suffisante, on estime que les cultures proviennent d'une seule cellule. Pour plus de sécurité, le procédé de clonage par dilution est répété. A une moyenne de 0,5 cellule par puits, on estime que 30 % des puits ne contiennent qu'une seule cellule. Cette méthode est une procédure en trois temps.  La première série de dilutions permet de sélectionner les cellules qui sécrètent de haut niveaux d ’anticorps. Effectuer des séries de dilutions pour obtenir cellules/ml et mettre en culture en milieu liquide HAT dans des puits de 0,3 ml. Laisser en incubateur 7 jours  La deuxième série de dilutions permet de sélectionner les lignées cellulaires à partir d’une seule cellule. Elle nécessite la présence supplémentaire d ’une couche de cellules de rate. Effectuer des séries de dilutions pour obtenir 1 cellule pour un puits ou deux puits. Mettre en culture en milieu liquide HAT. Laisser en incubateur jours en changeant le milieu régulièrement.  La troisième série de dilutions permet de vérifier le clonage.

21 CONSERVATION Aux divers stades de la sélection, les hybridomes choisis sont congelés. On pallie ainsi à toute contamination ou accident ultérieur et on a en phase finale du matériel d'inoculation pour la production. centrifuger un volume de suspension cellulaire contenant 107 cellules. Enlever le surnageant et mélanger avec le milieu de congélation préparé préalablement (0.9 ml de SVF et 0.1 ml de DMSO placé dans la glace) Transvaser dans un tube à congélation renseigné. Le placer à -20 °C pendant environ 30 minutes. Le transférer alors à -80°C pendant 1 journée. Le transférer et le conserver sous azote liquide.

22 PRODUCTION DES ANTICORPS PAR REALISATION D ’ASCITE
Pour la production in vivo, une ascite (épanchement péritonéal) est créée. Réaliser deux injections de 0,5 ml de pristane à une semaine d'intervalle chez une souris de lignée définie dont le fonctionnement du système immunitaire a été inhibé par une injection de tétraméthylpentadécane . Une semaine plus tard, injecter dans la cavité péritonéale de la souris environ 107 hybridomes dans un milieu sans sérum. Après une à deux semaines, recueillir par ponction de la cavité péritonéale 2 à 5 ml de liquide contenant 2 à 10 mg/ml d'anticorps, soit au maximum 50 mg par animal. La culture en ascite permet une production flexible de petites quantités d'anticorps monoclonaux (au maximum de l'ordre du gramme). Cette production in vivo présente cependant plusieurs inconvénients notamment la petite taille de la souris, la présence de nombreuses enzymes protéolytiques dans l'ascite. De plus le liquide de l ’ascite contient un mélange de protéines dont certaines sont des immunoglobulines. I1 se pose aussi le problème éthique de l'utilisation des animaux et de l'injection de cellules cancéreuses. La production in vivo devient de plus en plus une technique obsolète.

23 PRODUCTION EN BIOREACTEUR
Pour diverses applications, il est nécessaire de produire des quantités plus importantes d ’anticorps. Pour l'imagerie in vivo, on doit disposer de quelques centaines de microgrammes d'anticorps par patient, soit plusieurs grammes pour patients. Pour la thérapie in vivo plusieurs centaines de milligrammes sont requises par patient, soit plusieurs kilogrammes pour le traitement de patients. Les premières cultures s'effectuent dans des récipients à fond plat, les deuxièmes se font dans des bouteilles cylindriques mises à incuber sur un agitateur à rotation lente et régulière. La production a plus grande échelle peut s'effectuer soit en suspensions homogènes (réacteurs à agitation mécanique ou réacteurs "air lift" à agitation par circulation d'air), soit avec des cellules immobilisées (fibres creuses, microcapsules, cartouches de céramique). La capacité des bioréacteurs actuellement utilisés se situe entre 10 et litres. Les quantités d'anticorps produits sont fonction du type de cellule, du milieu et des conditions environnementales. La productivité se situe habituellement pour les anticorps murins entre 30 et 300 µg/ml.

24 PRODUCTION EN BIOREACTEUR
Les résultats en système "air lift" sont meilleurs que ceux observés dans les flacons agités (multiplication par un facteur de 2,5). Dans certains cas une augmentation considérable de la productivité spécifique (2 à 5 fois) est obtenue par des cultures réalisées avec des cellules en perfusion qui sont maintenues en phase stationnaire. Un cycle de production dure typiquement 6 à 16 jours. Pour une telle production, il est recommandé d’utiliser des milieux définis et non des milieux à base de sérum contenant un mélange complexe de protéines. On réduit ainsi les coûts de production et de purification. De plus, cela permet d'éliminer le risque de contaminations accidentelles par des virus ou des micro-organismes éventuellement présents dans le sérum. L'optimisation et la régulation de la production sont plus facile avec un milieu de composition définie (par exemple le milieu eRDF). Ces milieux contiennent encore souvent des hormones et des facteurs de croissances (prolactine, corticotropine, insuline, transferrine, testostérone et acide linoléique).

25 EXTRACTION ET PURIFICATION DES ANTICORPS PRODUITS
La première étape consiste à éliminer les cellules. Cela est réalisé facilement à grande échelle par centrifugation continue. L'ultrafiltration à flux tangentiel permet ensuite d'obtenir un concentré contenant habituellement 1 à 5 g d'anticorps par litre. Les techniques de purification dépendent des caractéristiques de l'anticorps et de l'usage que l'on peut en faire. Ces méthodes sont principalement les suivantes : - précipitation dans une solution de sulfate d'ammonium généralement à 50 %; - chromatographie par échange d'ions (DEAE par exemple); - chromatographie par filtration sur gel ; - chromatographie par affinité avec la protéine A du staphylocoque ou avec des anticorps anti-immunoglobulines fixés à de la sépharose activée. Les anticorps sont ensuite élués par des gradients de pH ou de force ionique. I1 est nécessaire d'utiliser des techniques peu agressives car les anticorps sont fragiles et facilement dénaturés. Pour des anticorps à utiliser in vivo, un degré de pureté élevé est requis. L'obstacle majeur tient non pas aux techniques de purification mais à la sensibilité des méthodes de dosage des impuretés.