TD N°3: MUTATIONS DE L’OPERON LACTOSE & TRYPTOPHANE

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1 TD N°3: MUTATIONS DE L’OPERON LACTOSE & TRYPTOPHANE
Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire Faculté des Sciences Rabat Filière SVI – S6 Module de Génétique et Biologie Moléculaire Elément 2: Biologie Moléculaire TD N°3: MUTATIONS DE L’OPERON LACTOSE & TRYPTOPHANE Année universitaire Dr. Leila MEDRAOUI

2 Exercice 1. I- On possède deux souches de bactéries, E. coli A et B. Les deux souches sont mises à pousser sur milieu de culture en présence ou en absence de lactose et leur capacité à synthétiser la β-galactosidase et la perméase est étudiée , voir tableau 1. Tableau1. Absence de lactose Présence de lactose Souche β-gal perm A - + B C D

3 L’ADN chromosomique de la souche A est soumis à une action enzymatique
L’ADN chromosomique de la souche A est soumis à une action enzymatique. La région du système lac est isolée puis clonée au site EcoRI du plasmide Pbr322 (figure 1). Le plasmide recombinant est ensuite utilisé pour transformer les bactéries de la souche B. La souche issue de cette transformation est appelée C. Sa capacité à métaboliser le lactose est étudiée dans les mêmes conditions que les souches A et B, voir tableau 1.

4 Questions : 1- Quelle (s) différence (s) génétiques fondamentale (s) existe (ent) entre la souche C et les souches A et B ?

5 1/ Les différences génétiques qui existent entre les souches A et B puis C sont:
-Les souches A et B sont haploïdes, la souche C est partiellement diploïde. -La souche C contient en plus de son chromosome principal un matériel génétique extra-chromosomique=un plasmide. 2/Quel est le mode de synthèse de chacune des enzymes chez les souches A, B et C ? 2/ -Pour la souche A, la β-gal possède un phénotype négatif, la perméase un phénotype constitutif. -Pour la souche B, la β-gal a un phénotype constitutif , la perméase est négative. -Pour la souche C, elle possède un phénotype constitutif pour la β-gal et inductible pour la perméase.

6 3/ Déduire le génotype des souches A, B et C. Justifier votre réponse.

7 DIPLOIDE PARTIEL I- O +Z+ … / I+ O+ Z+
• l'allèle I+ est dominant sur l'allèle I- • ces bactéries sont de phénotype [lac+ inductible].

8 DIPLOIDE PARTIEL Is O+ Z+ … / I+ O+ Z+
• l'allèle Is est dominant sur l'allèle I+ • ces bactéries sont de phénotype [lac-non-inductible].

9 DIPLOIDE PARTIEL I+ Oc Z+ … / I+ O+ Z+
• l'allèle Oc est dominant sur l'allèle O+ • ces bactéries sont de phénotype [lac+constitutif].

10 3/ Déduire le génotype des souches A, B et C. Justifier votre réponse.
3/ Génotypes des souches A, B et C: -Au niveau de la souche A, la perméase est constitutive. On remarque qu’elle est devenue inductible au niveau du diploïde partiel. Ceci veut dire d’une part que les autres gènes régulateurs sont sauvages: p+ et o+ et que la mutation constitutive portée par A est récessive. Celle-ci donc est i-. Il en ressort que le gène régulateur i est sauvage au niveau de B (i+). Le génotype de A est donc: i-p+o+z-y+ -Au niveau de la souche B, la β-gal qui est constitutive l’est restée au niveau du diploïde partiel C. Ceci veut dire qu’elle est portée par une mutation cis dominante à savoir o c . Le génotype de B est donc: i+p+ocz+y- Le génotype de C est donc: i-p+o+z-y+ / i+p+ocz+y-

11 Milieu contenant la Tétracycline Milieu contenant l’Ampicilline
II- L’ADN plasmidique de la souche C est extrait puis soumis à l’action de l’endonucléase de restriction Pst I. Le fragment plasmidique issu de cette digestion est isolé puis refermé sur lui-même et utilisé pour transformer les bactéries de la souche B. La souche issue de cette transformation est appelée D. Sa capacité à métaboliser le lactose est utilisée comme auparavant, (tableau 1). D’autre part, la capacité des quatre souches à résister aux antibiotiques est étudiée (tableau 2). Tableau 2. Souche Milieu contenant la Tétracycline Milieu contenant l’Ampicilline Milieu contenant Tétra+Amp A - B C + D + : présence de colonies ; - : absence de colonies.

12 Questions : 4- Quelle (s) hypothèse (s) probable (s) proposez-vous pour interpréter les résultats des tableaux 1 et 2 obtenus avec les souches C et D ? L’ADN plasmidique de la souche C a subit le traitement suivant:

13 L’analyse du résultat métabolique montre que la souche C ressemble à la souche D pour l’expression du système Lac. (Table 1.) Par ailleurs, l’analyse de la résistance aux antibiotiques montre que la souche D est sensible à l’ampicilline, alors que C est résistante. Ceci veut dire que le gène de résistance à l’ampicilline est perturbé chez la souche D.

14 L’hypothèse la plus probable pour interpréter ces résultats est l’existence d’un site PstI au niveau du système Lac. Celui-ci est situé au niveau d’une région qui ne perturbe pas la fonction de l’opéron puisque z et y s’expriment. Il en ressort que ce site est situé au niveau du gène régulateur i, ce dernier est donc de toute manière muté i-, l’action de PstI à ce niveau reste sans conséquence sur l’expression. Par contre l’existence de ce site PstI sur i, avec le site PstI appartenant au vecteur a supprimé un fragment du gène de résistance à l’ampicilline ce qui a provoqué la sensibilité à cette dernière au niveau de la souche D.

15 5/ Donner le génotype de la souche D.
5/ Le génotype de D est donc: i-p+o+z-y+ / i+p+ocz+y- 6/ Donner la cartographie de restriction des plasmides contenus dans les souches C et D.

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17 III- Les quatre souches A, B, C et D sont ensuite transférées sur un milieu (a) contenant du glucose, et sur un milieu (b) contenant du lactose et un excès de phosphodiestérase. 7- Résumer les résultats obtenus sous forme d’un tableau en ce qui concerne la synthèse de la β-galactosidase et de la perméase sur les milieux (a) et (b). Milieu (a) Milieu (b) β-gal Perm A - B C D

18 8- Proposer un modèle moléculaire pour expliquer à l’aide d’un schéma le fonctionnement de l’opéron lactose. Sur le milieu (a) qui contient le glucose ==>Répression catabolique =Effet glucose. Sur le milieu (b) à excès de phosphodiesterase (AMPc + H2O <=> AMP ) ==>Pas d’expression du système Lac.

19 Exercice 2. Quelles seraient les conséquences d’une mutation non sens au niveau du messager qui code pour le peptide leader ? Une mutation non sens au niveau du peptide leader aura les mêmes conséquences qu’il s’agisse d’une concentration faible ou élevée en tryptophane. Dans les deux cas, le ribosome quitte l’ARNm avant d’arriver aux codons tryptophane du peptide. Dans ces conditions, la région 1 reste libre pour s’apparier à la région 2, laissant ainsi la possibilité à la région 3 de s’apparier à la région 4. Ainsi, l’épingle à cheveux de l’atténuateur peut alors se former. Dans ces conditions, on ne peut avoir que la formation de l’ARNm court. En conséquence, dans le cas de cette mutation, quelque soit la concentration du tryptophane endogène, la bactérie sera incapable de le synthétiser. Source: Génétique moléculaire. M. Moumni, 2000, Edt Afrique Orient.

20 Source: Génétique moléculaire. M. Moumni, Edt Afrique Orient