Ordre de passage pour les présentations

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1 Ordre de passage pour les présentations
5 avril 12 avril 19 avril Ou

2 Techniques d’étude des interactions protéine-protéine à grande échelle
Hervé PHILIPPE BIN1002 – hiver 2013

3 Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine ?
beaucoup de matériel à disposition focus sur l’étude des fonctions cellulaires capacité des protéines à former des complexes ≈5 partenaires pour chaque protéine importance des complexes protéiques dans l’aspect fonctionnel  interactome

4 De nombreuses techniques d’étude
Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14 in vivo maintien du contexte cellulaire in vitro caractérisation détaillée des interactions (cinétique, stochiométrie …) validation des résultats in vivo

5 Co-immunoprécipitation

6 Double hybride Principe :
utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure domaine d’activation domaine de liaison à l’ADN fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent

7 Fusion protéines et modules du facteur de transcription
Double hybride Système rapporteur DA : domaine d’activation DL : domaine de liaison à l’ADN DA TF DL colonies de levures pas d’expression expression du gène mARN DA DL prot 1 prot 2 prot 3 Fusion protéines et modules du facteur de transcription mARN Expression du système

8 Double hybride Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340:245-246.
Avantages : expérience facile à mettre en place Inconvénients : analyse qualitative faux positifs si les interactions préexistent chez la levure faux négatifs : problème d’expression des protéines cibles chez la levure non applicable aux protéines membranaires (30% du protéome) Application : identification des interactions criblage de banque de protéines

9 Interactome chez Caenorhabditis elegans
Li S. et al.; Science 2004; 303:540–543

10 PCA : protein fragment complementation assay
Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91: Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7 Principe : rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente) fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à tester mesure de la reconstitution du rapporteur si les protéines testées interagissent

11 PCA : protein fragment complementation assay
Avantages : applicable pour les protéines membranaires réponse très rapide niveau d’expression naturel Inconvénients : décalage temporel de la réponse au signal d’expression création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique Application : identification des interactions étude des réseaux d’interaction

12 FRET (fluorescence resonance energy transfer)
L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: 819–846 R0 10-70 Å excitation nm émission accepteur 475 nm 525 nm donneur 475 525 Principe : excitation d’un fluorophore donneur par un photon émission fluorescence par le donneur excitation du fluorophore accepteur s’il est suffisamment proche mesure du rapport de fluorescence

13 FRET (fluorescence resonance energy transfer)
Avantages : étude dynamique en temps réel applicable in vivo dans le système cellulaire originel peut être couplé à un signal biologique applicable dans tous les compartiments cellulaires Inconvénients : création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions nécessite la surexpression des protéines testées Application : signification biologique des interactions localisation cellulaire par couplage avec des techniques de microscopie

14 TAP-Tag : Tandem Affinity Purification
Principe : 1. peptide de fixation à la calmoduline domaines de fixation de la ProtA aux IgG site de clivage à la TEV protéase 2. constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules fixation du complexe via la ProtA sur la colonne d’affinité et élution douce des contaminants clivage du tag par la protéase fixation du complexe via le peptide de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase élution du complexe et analyses subséquentes 3. 4. 5. Puig O. et al.; Methods 2001; 24:218–229

15 Spectrométrie de masse
Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21 Inconvénients : nécessite la purification des complexes méthode compliquée et relativement coûteuse Application : identification des protéines présentes dans un complexe

16 TAP-Tag : Tandem Affinity Purification
Avantages : seul l’appât est modifié, pas les autres protéines du complexe taux d’expression biologique des protéines identification de complexes avec plus de 2 protéines Inconvénients : seules les interactions très stables peuvent être détectées nombreux faux positifs (protéines « colle ») Application : identification des complexes protéiques

17 Arbre = réseau connexe non cyclique
Quelques définitions Arbre = réseau connexe non cyclique noeud branche Réseau connexe non cyclique Réseau non connexe non cyclique Réseau connexe cyclique

18 Jeong et al, Nature 2001

19 Qualité du réseau d’interactions
Très nombreuses interactions protéine/protéine détectées par différentes méthodes Pourquoi ? Les méthodes sont prévues pour détecter des interactions différentes (binaire pour le double hybride, interactions fortes pour la protéomique, etc.) Les méthodes se trompent (faux positifs, faux négatifs) Nécessité de valider les résultats

20 Qualité du réseau d’interactions
Construction d’un ensemble d’interactions validées manuellement interactions impliquant 1308 protéines de la levure Saccharomyces cerevisiae ( Coverage (couverture) : fraction des interactions de référence analysées par une méthode donnée Accuracy (précision) : fraction des interactions de référence retrouvées par une méthode donnée Von Mering et al, Nature (2002) 417:

21 Qualité du réseau d’interactions
Von Mering et al, Nature (2002) 417:

22 Qualité du réseau d’interactions
Von Mering et al, Nature (2002) 417:

23 Qualité du réseau d’interactions
Von Mering et al, Nature (2002) 417:

24 Qualité du réseau d’interactions
Filtrage : interactions détectées trois fois pour le double-hybride, par exemple Von Mering et al, Nature (2002) 417:

25 Von Mering et al. (2005) Nucleic Acids Research, 33:D433–D437

26 Distance et Distance caractéristique d’un réseau
la distance d(u,v) est la longueur du plus court chemin connectant deux noeuds, c-à-d le nombre minimal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v la distance caractéristique L = meanu,v d(u,v) d’un graphe est la longueur moyenne du plus court chemin connectant deux noeuds

27 Diamètre d’un réseau 3 4 5 7 le diamètre D = maxu,v d(u,v) d’un graphe est la longueur du plus long des plus courts chemins connectant deux noeuds, c’est-à-dire le nombre maximal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v lorsque les retours, détours et boucles sont interdits

28 Réseaux « Small-World »
dans un réseau Small-World, la plupart des noeuds sont voisins les uns des autres, c-à-d qu’il faut traverser un petit nombre de noeuds pour se rendre d’un noeud u à un noeud v ex : WWW ; liens sociaux entre les êtres humains formellement, on dit que son diamètre est petit (D ≤ 6) ces réseaux ont des distances caractéristiques faibles

29 Connectivité d’un réseau
la connectivité K d’un réseau est le nombre minimal de liens connectant deux noeuds u et v formellement, c’est le nombre minimal de noeuds qu’il faut supprimer pour déconnecter le réseau

30 Connectivité d’un noeud
la connectivité K d’un noeud (protéine i) est le nombre de liens émanant du noeud i Exponential Scale-free HUB Jeong et al, Nature 2000

31 Une autre représentation du réseau
6 3 7 4 8 2 5 1 9

32 Après un algorithme de clustering
6 3 7 4 8 2 5 1 9

33 Modular organization of cellular networks
1 P - polarity R - Ras related pathway H - Highly osmotic conditions M - Mating/filamentation Rives AW et al. PNAS, 2003

34 Modular organization of cellular networks
- Modules - Intermodular connections Rives AW et al. PNAS, 2003

35 Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi: /nature04532

36 Recherche de modules A(i,j) : indice de socio-affinité
ni;j|i=bait : nombre of fois où protéines i et j sont retrouvées quand I est étiquettée : nombre of proies récupérées quand i est un appât : nombre de fois où protéines i and j sont copurifiées avec d’autres appâts. Gavin et al. (2006) Nature, doi: /nature04532

37 Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi: /nature04532

38 Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi: /nature04532

39 Essentialité des gènes
Yu et al (2004) Trends in Genetics 20:

40 Essentialité des gènes
Hubs : 1061 protéines qui ont le plus grand nombre d’interactions Yu et al (2004) Trends in Genetics 20:

41 Robustesse du réseau aux mutations
Jeong et al, Nature 2000

42 Robustesse du réseau aux mutations
Freeland et al. (2000) Mol. Biol. Evol. 17:511–518

43 Perspectives : combiner les réseaux
Kelley & Iteker (2005) Nature Biotechnology  23: