Application à la toxicologie nucléaire

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1 Application à la toxicologie nucléaire
Atelier PARIS 7-8 Avril 2004 " Bases de données  " Intérêt des bases de données pour la spéciation des actinides en milieu biologique Application à la toxicologie nucléaire E.Ansoborlo V.Moulin, C.Moulin, L.Bion, P.Moisy, C.Madic, G.Cote Programme de Toxicologie Nucléaire

2 Plan de l’exposé Etudes dans le domaine de la Toxicologie Nucléaire Besoins de spéciation en Biologie Etat des connaissances Actinides-Biologie Eléments et milieux d’intérêts Groupe de travail CETAMA GT 32 "Spéciation"  Exemples d’application Perspectives

3 Domaine d’étude : Radiotoxicité (hors radiobiologie)
1. Etudes dans le domaine de la Toxicologie Nucléaire Eléments d’intérêt : Actinides, PF, PA Domaine d’étude : Radiotoxicité (hors radiobiologie) Dosimétrie Interne Toxicité chimique Modèles CIPR Programme ToxNuc-E

4 1.1 Modes de contamination : CIPR
Incorporation Métabolisme Organes cibles Excrétion

5 1.2 Programme de Toxicologie Nucléaire
Programme inter organismes (CEA-CNRS-Inserm-Inra) Programme multidisciplinaire : physique, chimie, biologie, biochimie, médecine… 2 orientations : Homme et Environnement Cibles moléculaires des actinides Toxico-cancéro,neurotoxicité, génotoxicité Décorporation des actinides Transporteurs membranaires, stress oxydant Spéciation en milieu biologique

6 Niveau cellulaire protéines élément chimique
transporteur protéines élément chimique ? Molecules cibles Mécanismes de protection/ detoxication Spéciation Effets sur physiologie cellulaire ADN MOX U+Pu macrophage pulmonaire Regulation génétique réponses Précoces/ tardives Toxicité chimique et /ou Toxicité radiologique

7 2. Besoins de spéciation en Toxicologie Nucléaire
Dimensionner les expérimentations Comprendre les mécanismes de transfert ou rétention Préparer et interpréter les études Décorporation

8 3. Etat des connaissances Actinides-Biologie

9 3.1 Bases de données existantes
Radionucléide Database (Inhalation, ingestion…) : Données biocinétiques(absorption sang, ingestion…) Base de données décorporation (en cours DSV/CARMIN) Familles de ligands, efficacité décorporante, Cst… Base de données toxicologiques (DEN/DSV) : comparaison Toxicologie/radiotoxicologie

10 Eléménts Milieux Familles ligands
4. Eléments et milieux d’intérêts Eléménts Milieux Familles ligands Sang Salive Sucs Gastriques Urine Lait Mat-fœtal Macrophages… Milieux Culture Minéral Organique Acides aminés, Protéines Sucres Cations base décorporants Actinides (Th, U, Np, Pu, Am…) PF (Cs, Sr, I, Tc, Se…) PA (Co, Ni…) Toxiques (Cd, Be…) Paramètres variants : C, pH, I, Redox +précipitation

11 Exemples de composition de milieux d’intérêt

12 Cahier des charges Métal/ligand
Acide de Lewis (Pearson) Hg Cd Ag Cu(I) Pb Zn Cu(II) Co Fe(II) Fe(III) Mn Ca Mg Cs Sr U cations mous cations durs intermédiaires Thiolates (S) Carboxylates (O) Carbonyles Imidazoles (N) Acides aminés protéines Acide aspartique Acide glutamique Glycine, Tyrosine… Transferine… Cystéine Glutathion Metallothionéine…

13 Cahier des charges Actinides/ligands
Contraintes Actinides Cations durs (Pearson) Degrés d’oxydation 3 à 6 (Am3+, Np4+, NpO2+, Pu4+, UO22+) Aptitude hydrolyse M4+> MO22+> M3+ > MO2+ Redox (ex : Np(IV), Np(V)) Nombreux complexes (OH-, H2PO4-, HCO3-) Cinétique de dissociation des complexes stables lente Ligands Atomes donneurs O>N>S Denticité ou Nb de sites donneurs Stéréochimie du ligand, taille Stabilisation (liaisons H) Sélectivité/(Na+, Ca2+…) Ionisé au pH physiologique Hydrosoluble Cinétique et thermodynamique Ratio Chelatant:métal (>1000:1) Toxicité et AMM (autorisation)

14 5. Groupe de travail CETAMA GT 32 "Spéciation"
Crée en 2000 avec 2 sous-groupes Bases de données (L.Bion, G.Cote) Méthodologie (D.Doizi) Objectifs Incrémenter Bases de données (BASSIST) Organisation d ’exercices intercomparaisons Production 1 Note technique " Spéciation "/an Réalisations Bases de données : U, Pu, Am, Np Notes techniques "Spéciation" : U, Pu, Co, Tox Production 1 Note technique Spéciation/an Workshop (2001, 2004), Publication (RCA)

15 Sources Familles ligands Etat des données
5.1. Etat des lieux données : ex Actinides Sources Familles ligands Etat des données NEA/OCDE PSI IUPAC Smith-Martell NIST IRSN Publications Minéral Organique Acides aminés, Protéines Sucres Cations base décorporants OH-, HCO3-, HPO4=, SO4=… OK Citrates… (Expertise) Données (Exp) manque données Données (OK) qq données (Exp)

16 5.1. Etat des lieux données : ex Actinides

17 6.1. Exemple d’application des bases de données
Spéciation des actinides dans le sang Précipitation intracellulaire de l’uranium (rein) Répartition différente de 3 espèces Pu (foie)

18 Spéciation actinides dans le sang
Pu4+ Am3+ Np02+ U022+

19 Spéciation actinides dans le sang
Pu4+ Th4+ Np4+ Np02+

20 Précipitation intracellulaire de l’U (rein)
Phosphore Uranium Spéciation théorique Toujours sur le modèle tubulaire proximal et donc sur la lignée cellulaire LLC-PK1, nous avons étudié le devenir intracellulaire de l ’uranium ainsi que les modifications de la morphologie cellulaire induites par l ’uranium en microscopie électronique en transmission. L ’image en MET montre pour une exposition de 24 h au système uranium-Carbonates une précipitation de l ’uranium sous formes de micro-aiguilles de phosphate d ’uranyle. Ces résultats etant très bien corrélés avec les données in vivo. Uranium sous forme bicarbonate [U]=8x 10-4M Précipités d’uranium / cellule LLC-PK1 (x 80000) Spectre analyse X (EDAX) 5

21 Rétention hépatique de différentes formes chimiques de Pu au cours du temps après contamination I.V.
1 7 14 30 90 10 20 40 50 60 70 80 238Pu-cit 239Pu-nit 239Pu-phyt Temps (jours) % activité injectée

22 6.2. Exemple de détermination de Constantes thermodynamiques
Spéciation du Neptunium dans le sang Décorporation de l’U par un Biphosphonate (EHBP) Système Cobalt-citrate, cobalt-cystéine

23 Exemples Np02+ Np4+ Cas du Neptunium (thèse R.Racine, Paris XI, 2001)
Nombreuses manip in vivo sur Np(IV) et Np(V) Dans le sang Np sous 2 formes Np02+ NpO2+ libre + NpO2HPO4- + NpO2CO3- Np4+ lié à la transferrine (log K1~22) Dans l’os sous 1 forme :Np4+ Np4+ lié hydroxyapatite Np4+ Np4+ en milieu citrate partiellement oxydé

24 Cas du Neptunium (thèse R.Racine, Paris XI, 2001)
Np4+ NpO2+

25 Caractérisation du complexe UO22+ - EHBP
- Famille des diphosphonates - Nombreuses études biologiques : Hoffschir (2000) Hengé-Napoli (1999) Ubios (2001) - Possède une AMM (maladie de Paget)

26 Constante de stabilité, I = 0.1 : Espèces : MH3L log b = 6.0 ± 0.4
Complexe UO22+-EHBP par ES-MS SLRT Constante de stabilité, I = 0.1 : Espèces : MH3L log b = 6.0 ± 0.4 MH2L log b = 11.0 ± 0.6 En accord avec Nash* log  = ± 0.01 (extraction) Titration à pH = 2 [UO22+] = M [EHBP] = 0 à 5 équiv. ESI-MS Constante de stabilité, I = 0.1 : Espèces : MH3L log b = 6.0 ± 0.6 Confirmation de la stœchiométrie du complexe 1 : 1 m/z = [(UO2)(H3L)(ClO4)2]- pH 2 m/z = [(UO2)(H2L)(H3L)] pH 4 *Nash K. L. Radiochimica Acta 1993, 61, 147.

27 Système Cobalt-citrate, cobalt-cystéine
Matrices simples pour étude fondamentale via plate forme spectroscopique Co-Citrate, Co-Cystéine, Co-EDTA (référence) Matrice biologique Sang, peau, foie Etudes cellulaires in vitro  Toxicité du Co sur les kératinocytes Spéciation du Co dans les lignées d’hépatocytes (prgm décorporation) Matrice environnement Sol, plantes, systèmes aquatiques…. Fixation du 57Co dans les sols Phytoextraction de cellules végétales (prgm transfert sol plantes)

28 Le ligand citrate: acide organique
Ligand très abondant dans les milieux biologiques et environnement Sang : 10-4M Solubilisation des métaux : transport et biodisponibilité pKa1 = 3.14 pKa2 = 4.77 pKa3 = 6.39 Utilisation sous forme d’acide citrique Peu de données concernant le système Co-Cit (1/1) en milieu aqueux Etude en ES-MS et CI-ICP/OES: Stoechiométrie 1/1 Confirmation de la constante de complexation Co(II)/Cit: Log b1 = 4.5  0.4 Pas d’observation du complexe Co-Cit en raison de son caractère labile Résultats en accord avec la littérature (A. A. Ammann, J. Chromatogr. A, 2002, 947, 205)

29 Le ligand cystéine: acide aminé
Rôle important dans la structure des protéines via sa fonction SH pKa (COOH)= 1.82 pKa (SH)= pKa (NH3+)= 10.36 Peu de données récentes concernant le système Co-Cyst (1/1) en milieu aqueux DH2 Présence de O2: oxydation de la cystéine 2RSH RSSR + 2H+ + 2e- (favorisée en milieu basique) Etude en ES-MS: Stoechiométrie 1/1 Activation sélective des sites: étude en fonction du pH Phénomènes rédox inhérents au couple Co3+/Co2+

30 les outils de spéciation
Etude du système Co – cystéine Spéciation par ES-SM Diagramme obtenu expérimentalement % des espèces Co(III)Cyst2 Co(II) libre A intégrer dans les outils de spéciation théorique type JCHESS Co(II)Cyst Co(II)DH2 Complexe 1-1 avec la cystéine majoritaire à pH5 Complexe avec la cystine (dimère) à pH neutre Complexe 1-2 avec oxydation de Co à pH basique "La spéciation du Co dans le domaine de la toxicologie nucléaire: milieux environnementaux et biologiques". NT CETAMA E. Ansoborlo et al.

31 Programme ToxNuc-E : plateforme spéciation
7. Perspectives Programme ToxNuc-E : plateforme spéciation Thèse Np-Pu/transferrine aspect redox (P.Moisy, 2004) Thèse Pu-protéines ES-MS (C.Moulin, 2004) Poursuite travaux GT 32 : intercomparaison Tc Note spéciation Np Publi intercomparaison Am (L.Bion) Intercomparaison solution U, phosphates, citrates Participation CDTP école des mines Organisation 2ème Workshop spéciation Institut Curie (15-16 Novembre 2004)