Biologie Moléculaire des cancers et applications thérapeutiques

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1 Biologie Moléculaire des cancers et applications thérapeutiques
Pr. C A Cuénod HEGP / LRI Necker

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7 Hypothèse de travail en cancérologie moléculaire
 Si nous comprenons les mécanismes responsables d’un type spécifique de cancer, nous aurons une approche rationnelle pour la prévention, le diagnostic précoce, le développement de nouveaux traitements. Gadzar PNAS Aout 2001

8 Facteurs des progrès Pendant les 30 dernières années nos connaissances sur la pathologie moléculaire des cancers ont progressé grâce : • Human genome project • Banques de tissus • Lignées cellulaires • Kits de biologie moléculaire

9 DNA Microarrays Spotted cDNA slides
1. Prepare a gene chip using all 6,200 yeast genes by PCR. 2. Spot the denatured DNA onto slides. 3. Prepare mRNA from two populations of cells. 4. Convert the mRNA into cDNA using nucleotides labeled with Cy3 (green for control) or Cy5 (red for experimental) 5. Mix the labeled cDNAs and hybridize to tethered gene cDNAs on chip. 6. Wash and read the intensities of the spots with a laser. 7. Analyze the data.

10 ………………………………………………………
Normal tissue Cancer ……………………………………………………… Extract RNA Extract RNA Synthesize cDNA copy with dUTP Cy 5 Synthesize cDNA copy with dUTP Cy 3 Mix and hybridize

11 Scanning and Data Extraction
………………………………………………………                                                                                                                                                                           

12 Green = expression higher in normal tissue
Red = expression higher in cancer tissue Yellow = same expression Iyer, et al. Science 283:83, 1999

13 TUMOR FORMATION Proliferation Cell Death Neoplastic Transformation
“stem-cell” Cell Death Differentiation Death

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15 Tumeurs Tumeurs Malignes = Cancer 1 - Croissance rapide
2 - Agressives (envahissement local) 3 - Récidives locales 4 - Métastases à distance 5 - Evolution fatale Tumeurs Bénignes

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17 Conséquences des modifications moléculaires des cellules tumorales
1 Autosuffisance en signaux de croissance 2 Résistance aux signaux anticroissance 3 Incapacité à réparer l’ADN - Instabilité génétique 4 Diminution de la sensibilité à l’apoptose 5 Réplication illimitée (immortalité) 6 Néoangiogénèse 7 Perte de dépendance à l’adhésion- adhésion altérée 8 Invasion tissulaire et métastases

18 Facteurs de carcinogénèse
Oncogènes: - récepteurs de croisance : erb-B2 - inhibiteurs des protéines inhibitrices - facteurs de transcription - voie de signalisation : Ras Défaut des gènes suppresseurs - régulateurs du cycle cellulaire : RB, p53 - molécules d’adhésion cellulaire : cadherine-E, C-CAM - inhibiteurs des protéines oncogènes : mxel Incapacité à réparer ou défendre l’ADN - réparation inefficace : MSH2, MLH1 - stress oxydatif : GSTP1 Echappement à la mort cellulaire - absence d’apoptose : Bcl2, Bclx, p53 - Potentialité de réplication illimitée : télomérases Néoangiogénèse Altération de l’adhésion Invasion tissulaire et métastases

19 Causes de carcinogénèse
Délétion Mutation Sur-amplification Modification des méthylations

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21 Horloge du cycle cellulaire
Assemblage de protéines qui interagissent au sein du noyau, exécutant les messages transmis par les voies de stimulation et d’inhibition.

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23 La voie de signalisation
Libération de facteurs de croissance dans le milieu intercellulaire Liaison à des récepteurs membranaires Transmission d’un signal jusqu’au noyau par des protéines du cytoplasme Les facteurs de transcription activent les gènes qui déclenchent/bloquent le cycle de la croissance cellulaire.

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30 Deux classes de gènes ont un rôle essentiel dans l’apparition de cancer 
• Les proto-oncogènes stimulent la croissance, • Les gènes suppresseurs de tumeurs l’inhibent. En cas de mutations de ces gènes, une prolifération cellulaire incontrôlée est à l’origine de cancer.

31 1) Autosuffisance en signaux de croissance : rôle des Oncogènes
surproduction de facteur de croissance. quantités excessives de facteur de croissance des plaquettes (PDGF), TGF alpha. récepteurs anormaux qui émettent en continu de signaux de prolifération même en l’absence de facteur de croissance. Erb-B2 perturbent la cascade des signaux cytoplasmiques. Les protéines codées par des gènes ras mutés perturbent l’activité des facteurs de transcription dans le noyau. famille myc produisent des facteurs de transcription Myc

32 Anomalies des récepteurs
HER2 Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 amplification du gène, avec formation de nombreuses copies et surproduction de la protéine HER2 20 % des cancers du sein. mauvais pronostic, HER1 ou REGF Epidermal Growth Factor Receptor

33 Oncogènes de la famille RAS (1)
Mutation présentes dans 25 % des cancers Activation de RAS entraîne une prolifération cellulaire Famille d ’oncogènes : H, N et K-RAS

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35 La maturation de la protéine Ras
Les protéines RAS doivent être modifiées par des farnésylations La localisation membranaire nécessite une méthylation de RAS

36 Protéines Kinases En aval de la signalisation par Ras, des protéines kinases sont activées, notamment - RAF protéine activée par le MAP, - ERK Kinase (MEK) - MAP kinase.

37 PI3 et Akt Ras active aussi une phosphatidylinositol 3 kinase (PI3 Kinase) qui elle même active la protéine kinase Akt (qui est un suppresseur de l’apoptose)

38 Receptor dimerization
HER2 HER3 Receptor dimerization, or pairing, is an essential requirement for HER function and for the signaling activity of all HER receptors. The dimerization process can occur between 2 different receptors from the HER family (heterodimerization, e.g., HER1 and HER3) or between 2 of the same receptors (homodimerization, e.g., HER1 and HER1).4 Stimulation by a specific ligand confers a specific dimerization profile that is tissue specific or tumor specific.4 38

39 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K);
Dimerization results in activation of the kinase domain, transphosphorylation, and the induction of intracellular signaling cascades that mediate cell growth and survival.1 The HER signaling network is highly complex with 10 possible dimeric receptor combinations, multiple associated ligands, and numerous intracellular pathways. Signaling diversity depends not only on the presence of specific receptors, but also on the characteristics of individual ligands. Ligands are bivalent. Not only are they selective for specific receptors, but they also have preferences for the second receptor partner.4 Two important signaling pathways activated by the HER family dimers are the PI3K/Akt pathway that promotes tumor cell survival, and the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway that stimulates proliferation.1 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K);

40 Phosphorylation of the receptor tyrosine kinase domain
The process of dimerization activates the cytoplasmic domain of the receptor, resulting in the autophosphorylation of multiple tyrosine residues within the domain. This in turn activates downstream proteins that lead to physiologic responses.3 40

41 Recruitment of adaptor proteins
Grb 2 Sos PI3K Shc The phosphorylated residues of the cytoplasmic domain act as binding sites for proteins containing Src homology 2 (SH2) or phosphotyrosine binding (PTB) domains. These include adaptor proteins such as Shc, Crk, Grb2, Grb7 and Gab1; kinases such as Src, Chk, and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K); protein tyrosine phosphatases SHP1 and SHP2; and guanine nucleotide exchange factors such as Sos.1,4 Each receptor possesses a distinct pattern of binding domains, and as a result will form distinct adaptor protein complexes on phosphorylation. This leads to variation in the downstream pathways they activate.4 The sequence of adaptor and signaling proteins shown in this and following slides represent only one of a number of sequences possible with HER family receptors. 41

42 Initiation of signaling pathways
Grb 2 Sos PI3K Shc Ras Raf The formation of a complex of adaptor proteins results in the activation downstream signaling pathways.1 All receptors in the HER family couple to the MAPK pathway.4 This is brought about through interaction between adaptor proteins and RAS GDP/GTP-binding proteins. Association of the PI3K adaptor protein with receptor tyrosine kinase domains leads to activation of the AKT pathway. P AKT MAPKK 42

43 Cytoplasmic signaling cascades
Shc Grb 2 Sos PI3K Ras Raf The RAS proteins initiate a cascade of phosphorylation events in associated signaling molecules, leading to the activation of the MAP kinases. P AKT MAPKK P GSK-3 MAPK 43

44 Relaying the message to the nucleus
P P PI3K Shc Grb 2 Sos Ras Raf MAP kinases transfer the signal through the cytoplasm to the nucleus. P AKT MAPKK P GSK-3 P MAPK 44

45 Activation of target genes
P P PI3K Shc Grb 2 Sos Ras Raf Ultimately, the activation and dimerization of HER family receptors results in the activation of target genes within the nucleus. These genes determine biologic responses, such as proliferation or differentiation. P AKT MAPKK P GSK-3 P MAPK Gene transcription 45

46 Dysregulated HER receptor activity is implicated in a number of tumors, including ovarian, breast, prostate, and lung.1 This dysregulation may be caused by receptor mutation or over-expression, or the excessive production of ligands. This can result in activation of downstream signaling pathways, leading to uncontrolled cell proliferation; increased potential for invasion, metastasis, and angiogenesis; and decreased apoptosis. 1,3

47 Therapeutic strategies are being developed which target HER family receptors. These agents are primarily monoclonal antibodies which block ligand binding to the receptors, or small-molecule tyrosine kinase inhibitors which prevent signal transduction via the tyrosine kinase domain of the receptor.1 Genentech BioOncology, in partnership with Roche, is investigating a HER dimerization inhibitor in Phase II clinical trials.

48 Stratégies thérapeutiques
Le trastuzumab (Herceptin) AC contre HER2 (proposé si score 2+) REGF inhibés par des inhibiteurs (Iressa) ou par des AC monoclonaux (Cetuximab) Farnésyltransférase inhibée pour ne pas produire de pRas mature (FTI ou Zarnestra) Antisens: un petit fragment d’ADN ou d’ARN inhibent les ARNm et bloquer la synthèse des protéines-kinases. L’Imatinib mesylate (Glivec) dirigée contre la protéine tyrosine-kinase produite par le BCR ABL des LMC, aussi active sur la protéine KIT et sur le récepteur du PDGF des Tum stromales.

49 Herceptin°(trastuzumab) : Ac nonoclonal « humanisé » à 95 %
Se lie au domaine extracellulaire du récepteur HER-2 inhibe la prolifération des cellules sur-exprimant HER-2 The biotech company Genentech gained FDA approval for trastuzumab in Sept 1998. Trastuzumab costs about seventy thousand dollars for a full course of treatment.

50 2) Résistance aux signaux anticroissance : rôle des gènes suppresseurs de tumeurs
Les gènes qui bloquent la formation de tumeur peuvent laisser se développer des cancers lorsqu’ils sont modifiés. Les principaux suppresseurs de tumeurs sont les pRB et p53.

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52 Perturbation des voies de l’inhibition
Le récepteur au facteur de croissance TGF-bêta peut devenir insensible Les protéines, en aval du récepteur, peuvent être absentes: p15, p16 et p21 (dont la fonction est d’interrompre la division cellulaire) pNF-1 qui inhibe la protéine Ras

53 Protéine RB De rétinoblastome Principal frein du cycle cellulaire
RB activé ralentit la réplication de l’ADN En l’absence de pRB, le facteur E2F provoque une prolifération anarchique des cellules

54 RB activé ralentit la réplication de l’ADN

55 En l’absence de protéine RB, E2F provoque une prolifération anarchique des cellules

56 3) Incapacité à réparer l’ADN
Sans les gènes de réparation, des mutations s’accumulent: 10 à 20 % des K du colon présentent des mutations des gènes MLH1, MSH2, PMS1 et PMS2 Les protéines ATM et p53 suivent le cycle cellulaire et empêchent la cellule d’entamer une étape si les étapes précédentes ne se sont pas déroulées normalement.

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58 4) Diminution de la sensibilité à l’apoptose

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60 p53 P53 a deux rôle essentiels :
• bloquer la division cell. par l’intermédiaire de p21 • entraîner le suicide cellulaire (apoptose).

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66 5) Immortalité cellulaire
La durée de vie des cellules est contrôlée par une horloge moléculaire qui les fait entrer en sénescence après un nombre limité de divisions. Une ADN polymérase, la télomérase, est capable de réparer les télomères, « immortalisant » ainsi les cellules.

67 Perte d’un télomère à chaque réplication

68 6) Néo-angiogénèse Cf cours ultérieur

69 7) Altération de l’adhésion

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74 8) Invasion tissulaire et métastases
Les cellules métastatiques présentent : des modifications du cytosquelette, une perte d’adhésion, Une perte de la polarité une mobilité accrue, elles expriment des enzymes protéolytiques de la membrane basale.

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77 Hematogenous Metastasis Basement Membrane Tumor Extracellular Matrix
Adhesion to and Invasion of Basement Membrane Basement Membrane Intravasation Hematogenous Metastasis Adherence to Basement Membrane and Extravasation Metastasis

78 Sites métastatiques

79 Les cellules tumorales circulantes utilisent des récepteurs pour se fixer à la fibronectine de la matrice extracellulaire

80 Des fragments de RGD bloquent les récepteurs que la cellule tumorale circulante utilise pour se fixer à la fibronectine de la matrice extracellulaire

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85 TUMOR CELL HETEROGENEITY
Tumor “stem-cell” Autocrine Growth-loop Metastatic Non-proliferative Growth Factor Independent Non-antigenic

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87 L ’étude des cellules au stade pré-néoplasique
Peut permettre : D’identifier des individus à risque De prévenir l ’apparition de cancers

88 L’avenir est aux traitements «sur mesure»
L’oncologie moléculaire devrait permettre de caractériser le profil génétique de chaque tumeur et de développer un ciblage moléculaire de médicaments. Le rôle de l’imagerie, qu’elle soit fonctionnelle ou moléculaire, sera essentiel dans ces stratégies de prise en charge.

89 Rôle de l’imagerie Surveillance des patients à risque,
Localisation des lésions, Prélèvements transcutanés, Ciblage spécifique (diagnostique), Suivi-évaluation de l’efficacité, Ciblage spécifique (thérapeutique), Injections in situ …

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99 Drug Target Clusterings Reveal Clues To Mechanism
5FU/DPYD L-Asparaginase /ASNS Nature Genetics 24: 236, 2000;

100 * Hsp 90 X Hsp 90 A. C. X-mRNA B. nucleus degradation nucleus Immature
ER folding X-mRNA ER PR etc Cyclin D Hsp 90 pAKT EIF2 kinase raf erbB2 EGFR lck, met, G0 telomerase B. nucleus * hsp 90

101 Three Dimensional View Of Geldanamycin Binding Pocket In Amino Terminus Of Hsp90
Stebbins et al, Cell 89:239, 1997

102 Challenges In Pursuing The Molecular Therapeutics Of Cancer
Must change thinking from histologic to molecular diagnoses (CGAP, array technology) Develop new means (imaging, probes) to assess molecular pharmacodynamics Must move away from cytotoxicity as sole primary endpoint: assess and evaluate cytostatic effect Promote patient participation in clinical trials Develop speed and efficiency in answering critical clinical questions

103 Goals For Cancer Drug Screening In The New Millennium
Associate novel chemotypes with defined targets may utilize purified targets at the “front end” may define targets in pathway/organisms may “retrofit” molecules to targets or pathways by statistical approaches Allows facile tools for chemical/pharmacological optimization Define targets of relevance to and translatable in early clinical trials

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105 Lapatinib GSK reporte à la fin 2006 ou au début 2007 le dépôt de la demande d'autorisation de son anticancéreux lapatinib, molécule candidate au traitement du cancer avancé du sein. Les résultats présentés au congrès de l'American Society of Clinical Oncology (ASCO) montrent que 35 % des 40 femmes incluses dans l'essai répondent au traitement en première intention. Celles-ci ont vu une réduction d'au moins 30 % de leur tumeur et un autre tiers a enregistré une stabilisation de leur cancer.

106 TYKERB: Lapatinib Nouvel inhibiteur de la tyrosine kinase dirigé à la fois contre: - le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) - le récepteur 1 de ce même facteur de croissance (EGFR).

107 HER2 is a proto-oncogene located on chromosome 17.
HER2/neu ErbB-2 EGFR2 Cell membrane surface-bound tyrosine kinase and is involved in the signal transduction pathways leading to cell growth and differentiation. HER2 is a proto-oncogene located on chromosome 17. 20-40% of breast cancers have an amplification of the HER2/neu gene or overexpression of its protein product, associated with increased disease recurrence and worse prognosis. Because of its prognostic role as well as its ability to predict response to trastuzumab, breast tumors are routinely checked for overexpression of HER2/neu. Overexpression also occurs in other cancer such as ovarian cancer and stomach cancer.

108 HER2/neu ErbB2 The oncogene neu is so-named because it was derived from a neuroglioblastoma cell line in rat. HER2 is named because it has similar structure to human epidermal growth factor receptor, or HER. ErbB2 was named for its similarity to ErbB (avian erythroblastosis oncogene B), the oncogene later found to code for EGFR. Gene cloning showed that neu, HER2, and ErbB2 were the same.

109 Thérapeutique ciblée L’exemple du Sorafenib (BAYER) Jacques DUMAS

110 Prolifération cellulaire
La cascade Ras/Raf/MEK/ERK EGF Ras Grb2 P Raf Sos Prolifération cellulaire MEK P ERK1/2 P Translocation

111 Raf kinase : approche par screening
Collaboration avec Onyx Pharmaceuticals Banque de composés testée 88 molecules identifiées (> 50% d’inhibition à 10 µM) GK00687 sélectionné pour la suite de l’évaluation O M e H N S O GK00687 c-Raf IC50 = 17 µM p382 IC50 = 260 nM Potentiel pour la synthèse en parallèle

112 Lead inhibiteur de c-Raf
Urée requise pour l’activité Amides moins actifs S O M e H N Potentiel SAR limité Peut être furane ou pyrrole GK00687 c-Raf IC50 = 17 µM tert-Bu le plus actif S O M e H N CH3 c-Raf IC50 = 1,7 µM

113 H H Chimie combinatoire N N S O COOCH3

114 H H Chimie combinatoire N N S O COOCH3

115 Synthèse de 1000 composés en parallèle
Chimie combinatoire Synthèse de 1000 composés en parallèle N O H c-Raf = 1,1 µM

116 Sorafenib (BAY 43-9006) c-Raf = 12 nM
Optimisation menant au sorafenib O N H N N O H c-Raf = 1,1 µM O H N C 3 C F 3 H N l O N H C 3 C H 3 N O l F Sorafenib (BAY ) c-Raf = 12 nM

117 Boucle d’activation ATP
B-Raf cristallisé avec ATP (Barford et al., Cell 2004, 116, 855) Boucle d’activation ATP

118 Sorafenib

119 Profil anti-kinase du sorafenib
c-Raf (protéine complète) 6 nM b-Raf (wild-type) 22 nM b-Raf (V600E) 38 nM p38  nM VEGFR nM VEGFR nM mVEGFR nM mPDGFR- 28 nM FLT nM c-Kit nM FGFR nM EGFR, HER-2, c-Met, > 10,000 nM IGFR-1, PKA, AKT, cdk-1, pim-1, GSK-3, CK-2, PKC , PKC , PKC , MEK, ERK-1 C F 3 l N H O Sorafenib Wilhelm et al., Cancer Res. 2004, 64, 7099.

120 Niveau de prolifération Cellules du granulome inflammatoire
L'accumulation du 18FDG au niveau des tumeurs est liée à de multiples facteurs Oncogenèse : phénomène complexe Niveau de prolifération cellulaire Hypoxie Vascularisation Viabilité cellule Cellules du granulome inflammatoire Prolifération Invasion Angiogenèse Apoptose

121 Cellules endotheliales
Nexavar inhibiteur multikinase : anti-prolifératif et anti-angiogénique (Sorafenib Bayer) PLC PI3K RAS RAF MEK ERK Nexavar® VEGF Noyau Nexavar® inhibe la prolifération et/ou la survie dans les cellules endothéliales Nexavar est un inhibiteur multikinase qui en complément de son action sur RAF a également une action sur les récepteurs impliquées dans l’angiogénèse (VEGFR et PDGFR) lui conférant une action anti-angiogénique , mécanisme d’action important pour les tumeurs vascularisées et possède également une action anti-proliférative. VEGF = vascular endothelial growth factor PI3K = phosphoinositide-3 kinase PLC = phospholipase C