Introduction sur PCR, Clonage et Séquençage

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1 Introduction sur PCR, Clonage et Séquençage
Sébastien Tempel UMR EcoBio 6553, Symbiose Irisa

2 Les méthodes de Clonage
Rappels Historique de la biologie moléculaire. Notion de biologie. La PCR Ses buts, sa technique. Les méthodes de Clonage Les vecteurs de clonage. Exemple d’un BAC. Le séquençage Nucléotidique : méthode de Sanger. Protéique : méthode Edman. Conclusion

3 Les méthodes de Clonage
Rappels Historique de la biologie moléculaire. Notion de biologie. La PCR Ses buts, sa technique. Les méthodes de Clonage Les vecteurs de clonage. Exemple d’un BAC. Le séquençage Nucléotidique : méthode de Sanger. Protéique : méthode Edman. Conclusion

4 Rappels historiques F. Miescher : substance dans les noyaux : l’ADN. G. Mendel : lois de l’hérédité. T. Morgan : chromosomes portent les gènes W. Astbury : structure filamenteuse de l’ADN. O. Avery : lien entre l’hérédité et l’ADN J. Watson et F. Crick : double hélice de l’ADN. F. Sanger : séquençage de l’insuline J. Monod et F. Jacob : ARNm intermédiaire ADN-protéine

5 Rappels historiques M. Nirenberg, G. Khorana et R. Holley : code génétique 1970 : M. Temin, D. Baltimore : identification de la reverse transcriptase. E.M. Southern : Méthode de séquençage des nucléotides W. Arber, D. Nathans, H. Smith : Identification des endonucléases. 1978 : Premier génome séquencé (virus SV40 de 5kb). K. Mullis : invention de la PCR. 1995 : Premier procaryote séquencé : Haemophilus influenzae. 15 avril 2003 : Séquençage génome humain terminé.

6 Les méthodes de Clonage
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7 Notion de biologie virus, cellules, organelles

8 Notion de biologie virus, cellules, organelles

9 Notion de biologie virus, cellules, organelles

10 Notion de biologie virus, cellules, organelles

11 Notion de biologie virus, cellules, organelles

12 Notion de biologie ADN et ARN
ADN : Acide DésoxyriboNucléique Rôle de l’ADN : pérenniser de génération en génération les informations de l’organisme. Localisation de l’ADN : Virus à ADN : intérieur de la capside Procaryote : chromosome circulaire, plasmide Eucaryote : Cellule végétale : chromosome, mitochondrie, chloroplaste … Cellule animale : chromosome, mitochondrie …

13 Notion de biologie ADN et ARN

14 Notion de biologie ADN et ARN

15 Notion de biologie ADN et ARN
ARN : Acide RiboNucléique Rôles de l’ARN : même que celui de l’ADN dans les virus à ARN, intermédiaire entre l’information portée par l’ADN et son expression par les protéines … Localisation de l’ARN : ARNm présent partout dans les cellules eucaryotes et procaryotes. ARNr et ARNt présents dans les organelles où est localisé l’ADN.

16 Notion de biologie ADN et ARN

17 Notion de biologie Acide Aminé

18 Notion de biologie Protéine
Structure primaire : séquence d’acide aminé. Structure secondaire : hélice alpha, feuillet bêta, pont disulfure. Structure tertiaire : suite de structure primaire et secondaire. Structure quaternaire : association de structure tertiaire Ex : tétramère d’hémoglobine, insuline...

19 Notion de biologie Protéine

20 Notion de biologie Protéine

21 Notion de biologie Protéine

22 Notion de biologie Protéine

23 Notion de biologie

24 Les méthodes de Clonage
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25 PCR Polymerase Chain Reaction
But de la PCR : Amplification d’ADN. Base pour différentes techniques de biologie moléculaire : Séquençage Amplification de l’ADN pour le clonage mutation ponctuelle « differential display » préparation d’ADNc « RT-PCR » détermination de polymorphisme entre génomes (RFLP…) ….

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27 Les méthodes de Clonage
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28 Clonage de séquences Vecteur de clonage :
Plasmide bactérien ( 3-4 kb ) Phage λ ( 9-22 kb ) Cosmide ( ≈ 45 kb ) PAC : P1-derived Artificial Chromosome ( kb ) BAC : Bacterial Artificial Chromosome ( kb ) YAC : Yeast Artificial Chromosome ( kb )

29 Les méthodes de Clonage
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30 Clonage de séquences Structure du BAC : oriS : origine de réplication
repE : maintient du nombre de plasmide à 1 ou 2 par cellule. parA, parB : stabilité du plasmide, incompatibilité avec les autres facteurs F. CMR : gène de résistance au chloramphénicol.

31 Clonage de séquences Structure du BAC :
Site de clonage dans le gène LacZ. T7 et SP6 : promoteurs forts de bactériophage. NotI, HindIII, BamHI : site de reconnaissance des endonucléases.

32 Clonage de séquences Digestion du vecteur et de l’ADN à cloner par HindIII. Sélection de l’ADN >150kb par électrophorèse.

33 Clonage de séquences Transformation de E.coli par électroporation :
Les bactéries à transformer doivent être en phase exponentielle de croissance. Le courant traverse les membranes des E.coli formant des pores sur les membranes. Les macromolécules chargées (comme les vecteurs) pénètrent par les pores des bactéries. L’intensité et la durée du champ électrique doivent être précises: Si trop faible les pores seront trop petits pour laisser entrer les vecteurs. Si trop fort, les pores ne pourront pas se refermer tuant ainsi la cellule.

34 Clonage de séquences Étalement des colonies sur un milieu contenant du chloramphénicol, de IPTG et de l’X-Gal. IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside) : sucre induisant la transcription du gène LacZ. X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside) : sucre donnant une coloration bleue s’il est utilisé (dégradé) par LacZ. Bactérie avec le plasmide (BAC) donnera des colonies : Couleur bleue si le plasmide ne contient pas d’ADN recombinant. Couleur blanche si le plasmide en contient.

35 Clonage de séquences

36 Clonage de séquences

37 Les méthodes de Clonage
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38 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger
ddNTP : analogues structuraux des dNTP. ddNTP : incapables de réaliser une liaison phosphodiester. ADN polymérase incorpore dNTP ou ddNTP.

39 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger

40 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger
Liaison de l’amorce avec l’ADN à séquencer. La fixation des ddNTP aux brins d’ADN va créer des brins de différentes tailles. Les brins vont migrer sur un gel d’électrophorèse selon leur taille : le plus petit migre le plus vite.

41 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger

42 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger
Automatisation de la méthode : Ajout sur les ddNTP de fluorochrome de différentes couleurs. 1 seul tube regroupant les ddNTP. Lecture par un laser des fragments qui migrent sur le gel. Stockage des données dans la mémoire de l’ordinateur.

43 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger

44 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger

45 Les méthodes de Clonage
Rappels Historique de la biologie moléculaire. Notion de biologie. La PCR Ses buts, sa technique. Les méthodes de Clonage Les vecteurs de clonage. Exemple d’un BAC. Le séquençage Nucléotidique : méthode de Sanger. Protéique : méthode Edman. Conclusion

46 Séquençage protéique Si on possède l’ARNm :
Réalisation d’une RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) : Transformation de l’ARNm en ADNc par la reverse transcriptase. PCR classique sur l’ADNc. Séquençage des nucléotides amplifiés par méthode de Sanger Si on ne possède que la protéine : Purification de la protéine par méthode de chromatographie Méthode d’Edman.

47 Séquençage protéique : méthode d’Edman

48 Les méthodes de Clonage
Rappels Historique de la biologie moléculaire. Notion de biologie. La PCR Ses buts, sa technique Les méthodes de Clonage Les vecteurs de clonage. Exemple d’un BAC. Le séquençage Nucléotidique : méthode de Sanger. Protéique : méthode Edman. Conclusion

49 Conclusion