Quelques conseils pratiques: Préparation des biopsies

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1 Quelques conseils pratiques: Préparation des biopsies
Conditionnement pour l’envoi des échantillons Nathalie Quellard, Sihem Kaaki, Corinne Lacombe, Julie Godet Service d’Anatomie et Cytologie Pathologiques Unité de Pathologie Ultrastructurale,CHU Poitiers Paris, 16 janvier 2015 Centre de référence Amylose AL et autres maladies par dépôts d’Ig monoclonales

2 Intérêt d’une bonne préparation
Interprétation fiable et rigoureuse Diagnostic assuré Mise en place d’un traitement Techniques coûteuses

3 Réalisation des biopsies
Prélèvement au lit du patient - Microscopie optique:  Duboscq Brazil - Immunofluorescence:  Azote liquide - Microscopie électronique  Glutaraldéhyde Plonger le plus rapidement possible les fragments biopsiques dans les liquides de conservation

4 Microscopie photonique
Service AnaPath Fixation - Duboscq Brazil (éthanol, ac.acétique, formol, ac.picrique) - 6-8H à 20°C ou 24H à 4°C - Conservation formol tamponné 10% Coloration Topographie générale des dépôts Détection des dépôts amyloïdes HES 3µm Rouge congo 5µm Lumière polarisée

5 Typage des dépôts: Immunofluorescence
Mauvais rendement sur bloc paraffinéPrélèvement congelé Système révélateur Anticorps primaire Antigène Echantillon Epitope Vaste gamme d’anticorps: IgG, IgA, IgM, kappa, lambda, ss-classes IgG, TTR, SAA… Cryotube + support carton Support de congélation + cryocolle Plonger rapidement dans l’azote liquide

6 Biopsie de graisse sous cutanée
Rappels: - Possibilité de transport en sérum physiologique à 4 °C - Si rouge Congo réalisé au labo:  Coupes de 7 µm d’épaisseur ( Rouge Congo et IF) Ne jamais fixer les prélèvements en acétone

7 Microscopie électronique (Unité de Pathologie Ultrastructurale et Expérimentale Service Anatomie et Cytologie pathologiques ) Localisation précise Organisation Diamètre et structure des fibrilles (amyloïdes ou microtubulaires) 2 possibilités: Prélèvement Fixation Inclusion Bonne qualité de l’échantillon  Fiabilité de l’interprétation

8 Fixation La fixation doit être réalisée rapidement après exérèse
Vide poussé Impact électronique Nécessité d’une bonne fixation Morphologie et structure préservées Pas de destruction irréversible Processus enzymatiques immobilisés Autolyse dès 1ères sec après exérèse La fixation doit être réalisée rapidement après exérèse

9 Comment fixer? Conservation à -80°C jusqu’à l’envoi en carboglace
Fixation physique: Cryofixation - Congélation rapide dans l’azote liquide Conservation à -80°C jusqu’à l’envoi en carboglace

10 Comment fixer? Fixation chimique : glutaraldéhyde 2-4%
- Réticulation du gel protéique - Inhibition de l’autolyse Immersion rapide dans le fixateur Découpe dans le fixateur Fragment < 2 mm3 Conservation dans le fixateur à 4°C et min 1H La fixation chimique consiste à reconstituer artificiellement le gel protéique du vivant très hydraté (75% à 95% d'eau) afin de rendre les molécules d'un échantillon insolubles dans l'eau comme dans les solvants organiques, et ainsi bloquer les systèmes enzymatiques pour éviter toute modification structurelle ultérieure de l'échantillon. En effet, l'échelle très fine à laquelle se font les observations en microscopie électronique impose de conserver, sans modification, les structures correspondant à l'état vivant.     Le glutaraldéhyde (COH(CH2)3COH) est un dialdéhyde qui interagit rapidement avec les protéines. Il stabilise les structures en créant des ponts artificiels entre les protéines et des groupements animés libres: Avec deux groupes aldéhydes séparés par une chaîne flexible, HCO-(CH2)3-CHO, il possède un grand potentiel de création de ponts, qui peuvent apparaître grâce aux deux groupes et à des distances variables Composé d’oligomères de grande taille pénètre donc lentement

11 Fixateur utilisé en ME Glutaraldéhyde: COH(CH2)3COH - 2 aldéhydes libres autour d'une chaîne carbonée aliphatique - Ponts méthylène entre fonction amine des protéines et aldéhyde - Fixation rapide mais pénétration lente (1mm/h) - Fixation +++protéines, chromatine, acides nucléiques Il est très important d'utiliser un glutaraldéhyde "EM grade" Composé uniquement de monomères, les seuls de taille suffisamment réduite pour pénétrer rapidement le tissu (les autres formules sont destinées à tanner le cuir !)

12 Préparation du fixateur
Protocole de préparation sur le site du CR: - Respect du milieu intérieur cellulaire: Composition de la solution contenant le fixateur: -Osmolarité (saccharose, NaCl) -pH ( tamp. phosphate, tamp.cacodylate) - Concentration : entre 2 et 4% - Quantité: fois le volume des pièces à traiter - Volume des pièces à fixer : 1 à 2 mm3 - Température de fixation : 4°C 1H minimum - Qualité du fixateur : date de péremption Rapidité de la fixation Délai entre l’exérèse et la fixation < 30 secondes

13 Effet de la pression osmotique dans le tampon de préparation des fixateurs
Solution hypertonique Solution hypotonique La solution fixatrice doit être osmotiquement équilibrée par rapport au milieu cellulaire du tissu étudié

14 Bonne fixation Pb osmolarité Fixation tardive Mauvaise congélation MO

15 Séjour prolongé dans le tampon
mitochondrie noyau Séjour prolongé dans le tampon Fixation tardive

16 Envoi du fixateur possible par courrier avant biopsie
8nm Conservation une quinzaine de jours à 4°C dans le glutaraldéhyde  Sans altérations ultrastructurales (pas de surfixation) Envoi du fixateur possible par courrier avant biopsie

17 Biopsie perpendiculaire à l’axe de coupe
Inclusion Permet la confection de coupes ultrafines (50-80nm) Faible pouvoir de pénétration des électrons dans la matière Evite toute évolution du tissu sous l’action des électrons Disposition de la biopsie dans le moule Axe de coupe Biopsie perpendiculaire à l’axe de coupe

18 Conditionnement des biopsies pour l’envoi
Biopsie fixée au glutaraldéhyde: -Envoi dans cryotube rempli de fixateur envoi à 4°C Biopsie congelée: - Envoi en carboglace Mettre suffisamment de carboglace Eviter le week-end Eviter le colissimo

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