ENZYMOLOGIE -Principe général

Présentation au sujet: "ENZYMOLOGIE -Principe général"— Transcription de la présentation:

1 ENZYMOLOGIE -Principe général
Spécificité de l'association [protéine - ligand] -Contrôle de l'activité enzymatique FLEXIBILITÉ CONFORMATIONNELLE DES PROTÉINES Interactions protéine-ligand Enzymes Allostériques Interactions Protéines-Ligands Pr Miloud SLIMANI Département de Biologie Faculté des Sciences Université de Saida (Algérie) Pr.M SLIMANI

2 Principe général : Comme pour toute protéine, un mécanisme enzymatique commence par la fixation d’un substrat (ligand) par des liaisons faibles entre les fonctions portées par celui-ci et des restes d’aminoacides ou des cofacteurs , une zone particulière de l’enzyme dite site de fixation A ce site, le substrat est transformé en produit, puis celui-ci est libéré. Le site de fixation du substrat est dit site actif. Ligand :Corps chimique ayant une liaison spécifique avec une enzyme . Site actif

3 Il existe quatre types d’enzymes possibles :
_ Protéine enzymatique seule. _ Apoenzyme + coenzyme. _ Apoenzyme + ion. _ Apoenzyme + coenzyme + ion. Apoenzyme + Coenzyme = Holoenzyme Le terme holoenzyme :est l'assemblage du cofacteur (qui peut être un ion métallique, ou une molécule organique) et d'une ou plusieurs chaînes protéiques, formant ainsi une enzyme complète et active. L'holoenzyme est donc le complexe enzymatique catalytiquement activé par ses cofacteurs. La partie protéique de l'enzyme est alors nommée apoenzyme et la partie non protéique coenzyme . Lorsque la partie non protéique est un ion métallique (oligo-élément) , le complexe est alors nommé métalloprotéine.

4 Co-facteurs: Corps chimique intervenant dans une réaction enzymatique : - pour transporter ou compléter un substrat ; - pour accepter un produit ; - comme participant à la structure de l’enzyme. Plusieurs enzymes ont besoin de co-facteurs pour agir. Co facteur métallique être des ions (Fe2+, Mg2+, Zn2+ de l’anhydrase carbonique., etc) qui sont indispensable à l’activité enzymatique : _ Soit parce qu’il est responsable de la stabilité de la structure tertiaire de l’apoenzyme. _ Soit parce qu’il intervient dans la fixation du substrat. _ Soit parce qu’il participe directement à la catalyse. Enzyme Anydrase carbonique , la présence d’une atome de Zn est indispensable à son activité

5 Certains cofacteurs sont des molécules plus complexes synthétisées par les cellules : coenzymes.
Les coenzymes sont des molécules organiques qui sont cofacteurs de certaines protéines enzymatiques avec lesquelles ils forment souvent un complexe stable. La protéine seule est appelée apoenzyme, associée à son ou à ses coenzymes, on parle d'holoenzyme. En général, seule l'holoenzyme est catalytiquement fonctionnelle. Les coenzymes sont en général impliqués directement dans la catalyse, par exemple au travers de réactions de transfert d'électron, de proton, de groupements fonctionnels ou encore sont impliqués dans le transport du substrat entre sites actifs. Il y a deux familles de coenzymes : - ceux qui ne sont que transitoirement liés à l’enzyme et que l’on considère alors comme des co-substrats, - ceux que l’on nomme groupes prosthétiques et qui sont liés de façon covalente à la protéine.

6 Cofacteurs:

7 Spécificité de l'association [protéine - ligand] - Notion de site actif
Toutes les protéines (sauf les protéines intrinsèquement non structurées) se replient dans une conformation dite native et c'est dans cette conformation qu'elles acquièrent leur activité biologique (leur pouvoir de catalyseur dans le cas des enzymes). Ce repliement aboutit à une structure tridimensionnelle fonctionnelle unique de la protéine. -Cette structure globale de la macromolécule permet à une région particulière, le site actif  (souvent enfoui au sein de la protéine), d'adopter elle aussi une structure spatiale qui est reconnue par le ligand spécifique de la protéine  Le site actif d’une enzyme est la région tridimentionnelle qui se lie au substrat , une petite zone privilégiée de la protéine enzymatique dont la géométrie a une importance considérable sur la spécificité, il est situé dans une zone hydrophobe dans la partie interne de la structure. Il assure deux fonctions :

8 -fixation du substrat ( site de fixation , de reconnaissance) est constitué de certains Acides aminés qui sont associés avec l’orientation du substrat , et donc, avec la spécificité de l’enzyme ,responsable de la stéréospécificité. -transformation du substrat ( site catalytique ) est constitué des résidus qui sont directement impliqués dans la formation et rupture des liens chimiques. Ces résidus sont souvent localisés dans le fond de la cavité, et dans la majorité des cas, possèdent des chaînes latérales ioniques ou réactives (ex. His, Lys, Cys, Ser, Asp, Glu). -Les autres AA sont qualifiés d'auxiliaires, de collaborateurs ou de non collaborateurs selon leur degrés d'intervention dans l'acte catalytique

9 La stéréochimie qui résulte de cet agencement unique des acides aminés qui constituent le site actif est la cause de la stéréospécificité de reconnaissance  entre ces acides aminés et le (ou les) ligand(s). Le substrat induit un changement conformationnel du site actif de l'enzyme. Les orbitales des groupements catalytiques et du groupement réactionnel du substrat sont alignées de manière optimale pour l'acte catalytique . Substrat (S): est la molécule qui entre dans une réaction pour y être transformée grâce à l’action catalytique d’une enzyme. Produit (P) :la nouvelle molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par une enzyme est appelée produit.

10 LIAISONS ET INTERACTIONS DES PROTÉINES
Toutes les protéines assument leurs fonctions biologiques au moyen de liaisons ou d’interactions stéréospécifiques avec des ligands très divers : électrons, ions, molécules organiques ou bio -polymères. Ainsi, dans une cellule, toute molécule a été liée au récepteur qui lui a permis d’y pénétrer ou à l’enzyme qui l’a produite et toute molécule sera liée au transporteur qui la dirigera vers sa destination ou à l’enzyme qui la transformera. Des protéines s’associent étroitement entre elles pour former de larges complexes dont la masse moléculaire peut atteindre des millions de daltons ; certaines s’unissent à des polysaccharides ou à des lipides pour participer à l’édification des membranes ; d’autres entrent en interaction avec le DNA pour contrôler sa réplication et son expression ou avec des RNA pour réguler la biosynthèse des protéines elles-mêmes. Certains complexes entre protéines sont permanents, et c’est le cas des protéines multimériques ou des complexes multienzymatiques ; d’autres sont transitoires, et c’est le cas des enzymes liés à leur inhibiteur protéique, ou des anticorps fixés à leur antigène protéique.

11 Interactions protéine-ligand
k+1 k-1 k+2 ES E+P E +S La liaison se réalise grâce aux forces entre molécules, telles que les liaisons ioniques, les liaisons d'hydrogène et les forces van der Waals. Généralement, l'interaction est réversible et plus ou moins forte suivant le nombre et la nature des liaisons formées. La force de cette interaction est définie par la constante de dissociation .La liaison d'un ligand à une protéine réceptrice modifie souvent la conformation de cette dernière. L'énergie associée aux interactions intermoléculaires formées entre la protéine et son ligand permet de promouvoir ce changement de conformation, appelé ajustement induit. Cette modification structurale peut ainsi moduler éventuellement son état fonctionnel et son activité.

12 Deux modèles pour expliquer la spécificité des enzymes:
La complémentarité stérique entre l’enzyme et son substrat est a l’origine de cette spécificité et que les enzymes et les substrats se reconnaissent comme une clé s’adapte dans une serrure Forme induite: l’enzyme change sa conformation lors de la liaison du substrat Ajustement induit dynamique -lors de la fixation de substrat, l’enzyme change de conformation Suppose que l’enzyme a une structure flexible

13 FLEXIBILITÉ CONFORMATIONNELLE DES PROTÉINES
Les protéines, comme toutes les autres macromolécules biologiques, ne sont pas rigides. Leur structure fluctue autour de son état d’équilibre et adopte de nombreuses conformations dont certaines sont même susceptibles d’affecter la forme globale de la molécule. Ces fluctuations jouent un rôle important dans les propriétés fonctionnelles des protéines. Elles leur confèrent la possibilité de s’adapter à un changement de milieu environnant ou de fixer des ligands d’une manière optimale, pour la catalyse par exemple .De plus, des changements conformationnels importants permettant la transition d’un état à un autre sont nécessaires pour réguler l’activité, par exemple le passage d’un état inactif à un état actif ou d’un état de faible affinité à un état de forte affinité. Ainsi, dans le cas des protéines allostériques, l’activité biologique est contrôlée par des mouvements globaux faisant suite aux interactions des substrats eux-mêmes ou de leurs produits, ou encore à la fixation d’effecteurs

14 Changement conformationnel et flexibilité
L’hexokinase catalyse la réaction : glucose + ATP glucose-6-P C’est une étape clé du métabolisme des glucides La fixation de glucose entraîne une modification conformationnelle indispensable à la mise en oeuvre de la catalyse

15 Modulabilité: L’activité d’une enzyme est contrôlée par des modulateurs : Les activateurs augmentent l’activité. Les inhibiteurs la diminuent. Cette modularité permet d’ajuster la vitesse globale d’un métabolisme au besoin cellulaire Exemple : La phosphofructokinase est activée par l’AMP et inhibée par l’ATP. Cette modulation active ou inhibe la glycolyse selon que la charge énergétique est faible ou élevée.

16 ENZYMES ALLOSTERIQUES
1-Définition Le terme allostérique vient du grec allos, autre, et stereos, forme. Les enzymes allostériques ont une structure quaternaire ,ce sont des protéines complexes composée de plusieurs sous-unités. Souvent leurs sous unités sont disposées de manière à ce que la molécule ait un axe de symétrie. Chaque sous unité peut fixer une molécule de substrat. Il existe au moins un site de fixation pour le substrat (site actif, catalytique) et au moins un site de fixation (spécifique) pour un modulateur (site régulateur). Les enzymes allostériques prennent une autre conformation à la suite de la liaison du modulateur

17 2-Propriétés des enzymes allostériques :
Cinétique des E allostériques - Vitesse en fonction de [S] Les enzymes allostériques se distinguent des autres enzymes (michaeliens) par leur courbe v=f(S) qui n’est pas une hyperbole correspond à l’équation Michaelis Menten , mais une courbe sigmoide . Une cinétique sigmoïde reflète en général des interactions coopératives entre plusieurs sous unités protéiques .

18 Cette propriété de coopérativité des protomères donne un avantage aux systèmes allostériques par rapport aux enzymes à cinétique michaelienne pour la régulation de la vitesse des réactions enzymatiques Effet de coopérativité : la coopérativité traduit le fait que la fixation sur l'enzyme d'une molécule d'un effecteur allostérique influe sur la fixation des molécules suivantes. Dans le cas de coopérativité en présence du substrat: -Si l'effecteur allostérique est le substrat lui même on parle de modulation homotrope - Si l'effecteur est différent du substrat on parle de modulation hétérotrope -Dans une coopérativité positive, une molécule d'un effecteur entraîne l'augmentation de l'affinité pour les mêmes molécules et vice versa pour une coopérativité négative

19 Formalisme de Hill L'équation de Hill concerne le cas particulier de la fixation d'un même ligand sur plusieurs sites d'une protéine oligomérique possédant un site de fixation sur chaque monomère. L’équation exprime le degré de saturation d’une protéine oligomérique en fonction de la concentration en ligand θ: la fraction des sites comportant un ligand lié, [L] est la concentration de ligand et Kd est la constante de dissociation apparente. La constante n s'appelle la constante de Hill , décrit le degré de coopérativité de la fixation du ligand n : paramètre qui dépend du degré de coopérativité entre les sites de liaison du ligand en interaction la constante de Hill (n) augmente avec le degré de coopérativité d’une réaction

20 Si n=1,l’équation est celle d’une hyperbole ; la réaction de liaison de ligand est dite non coopérative. L'équation de Hill se réduit alors à une fixation simple, comme dans l'équation de Michaelis-Menten. Si n>1 est à coopérativité positive : la liaison du ligand augmente l’affinité de E pour les liaisons du ligand ultérieures .La coopérativité se traduit par une courbe de saturation de forme sigmoïde, d'autant plus marquée que la coopérativité est forte Si n < 1, la réaction est dite à coopérativité négative : la liaison du ligand diminue l’affinité de E pour les liaisons ultérieures du ligand: la fixation est anticoopérative. Plus le nombre de Hill, n, est grand et plus la coopérativité est forte. En général, n est inférieur au nombre de sites, c'est-à-dire au nombre de sous-unités de la protéine.

21 Modélisation : La transition concertée de Monod, Wyman et Changeux (MWC) . - Enzyme allostérique : oligomères (plusieurs sous-unités) - Chaque protomère (sous-unité) ne contient qu’un seul site pour un ligand -Les sous-unités (protomères) sont équivalentes afin que chaque oligomère possède au moins un axe de symétrie. -selon la théorie de l'allostérie chaque sous unité catalytique peut exister sous deux états conformationnels R ou T : -une forme T tendu (tense) à faible faible affinité pour le substrat ou sous forme R : relâché ( relased ) à forte affinité pour le substrat . - Ces états sont en équilibre et ceci indépendamment de la liaison d’un ligand à l’oligomère - Deux sous-unités de différentes conformations ne peuvent pas s’associer

22

23 Modèle symétrique Lorsque l’énergie interne d’un protomère augmente par suite de la modification de ces liaisons, on dit qu’il passe à un état tendu. Au contraire lorsque les dites liaisons lui imposent une structure correspondant à une énergie interne diminuée, on dit qu’il passe à un état relâché c'est la fixation du ligand qui modifie l'équilibre entre les formes R et T. En présence du substrat , l’équilibre est déplacé vers R  Un effecteur activateur favorisera le maintien de la forme R de l'enzyme. En l’absence du substrat , l’équilibre est en faveur de T Un effecteur inhibiteur favorisera le maintien de la forme T de l'enzyme

24 Modulations allostériques de types K et V :
Les enzymes allostériques peuvent être distingués selon les effets exercés sur elles par les effecteurs homotropes et hétérotropes qui les concernent. Ainsi, on distingue: 1-Les enzymes du système K (K est le symbole de la constante d'affinité ) où l'effecteur ne modifie que l'affinité apparente (K 1/2 équivalent Km) de l'enzyme pour le substrat.

25

26 2- Les enzymes du système V où l'effecteur ne modifie que la vitesse maximale (Vmax) de la réaction.

27 Action des effecteurs allostériques
Activateurs allostériques Activateur allostérique déplace l’équilibre T -----R vers R : l’affinité de l’enzyme pour le substrat est augmenté, la K0.5 est diminué , La courbe v=f(S) est déplacée vers la gauche inhibiteurs allostériques Un inhibiteur allostérique déplace l’équilibre T---R vers T : l’affinité de l’enzyme pour le substrat est diminué , la K0.5 est augmentée, la courbe v=f(S) est déplacée vers la droite .L’inhibition allostérique est un phénomène hétérotrope négatif

28 Importance des enzymes allostériques
Ont un rôle de régulation très important dans la cellule: En général l’enzyme allostérique catalyse la 1ère réaction, limitante d’une voie métabolique .Son activité peut être contrôlée par des activateurs ou inhibiteurs appartenant à cette voie métabolique permettent l’adaptation du métabolisme au besoin de la cellule. A le substrat de E1 enzyme clé, allostérique, est un modulateur positif (= activateur allostérique, il active l’enzyme) et X, le produit final est un modulateur négatif (= inhibiteur allostérique, il inhibe l’enzyme). En effet ,dans certains systèmes multi-enzymatiques, l’enzyme régulateur est inhibé de façon spécifique par le produit terminal de la voie métabolique X , chaque fois qu’il se trouve en excès par rapport aux besoins. Ce type de régulation est appelée rétrocontrôle (inhibition par «feed-back»).

29 Exemple d’allostérie : l’hexokinase
L’hexokinase est une enzyme de la membrane plasmique : catalyse une réaction de transfert de phosphate et d’énergie du coenzyme ATP vers le glucose qu’elle active en glucose-6-phosphate. Un proton est libéré. • La réaction couplée est exergonique et irréversible. • Le glucose-6-phosphate, produit de la réaction catalysée, est en outre un régulateur allostérique de l’hexokinase. Il se fixe sur un site de liaison différent du site actif et cette fixation diminue l’affinité du site actif pour le glucose. Il en résulte un ralentissement de la vitesse de réaction.

30 Intéractions Protéines – Ligands Introduction :
La quantification des sites de fixation d'un ligand sur une protéine nécessite en général la mesure de la concentration de ligand lié à la protéine à l'équilibre thermodynamique. Protéine à un site de fixation : La fixation à l'équilibre d'un ligand sur une protéine qui possède un site de fixation pour ce ligand est régie par un équilibre thermodynamique : K1 P + L P-L [P][L]/[P-L] = K-1/K1 = Kd K-1 [P] = concentration de la protéine libre, [L] = concentration de ligand libre, [P-L] = concentration de la protéine complexée. Pr M.SLIMANI

31 [P-L] = [Pt] x ([L]/Kd+[L])
Ces 3 concentrations étant définies lorsque l'équilibre thermodynamique est réalisé. En utilisant la relation de conservation de la protéine ([Pt] = [P] + [P-L]); on en déduit que [P-L] dépend de [Pt], de Kd et de la concentration de ligand libre selon une loi hyperbolique : [P-L] = [Pt] x ([L]/Kd+[L]) On parle alors d'une saturation Michaelienne (par analogie avec l'équation de Michaelis donné pour la vitesse d'une réaction enzymatique). L'expression de [P-L] : complexe formé, est constituée de deux termes indépendants : [Pt] = concentration totale de la protéine ([L]/Kd+[L]) : ne dépend que du rapport [L]/Kd qui varie entre 0 et 1, et renseigne sur le degré de saturation de la protéine, on l'appelle la fonction de saturation Ÿ. Sa valeur est égale à 0,5 (demi-saturation) quand la [L] libre ([L]0,5) est égale à Kd. Pr M.SLIMANI

32 Kd = (Σ[protéine libre])x[L libre]/Σ[protéine complexée]
Remarque: Lorsque l'on est présence d'un équilibre plus complexe (la protéine libre ou la protéine complexée pouvant exister sous différentes formes en équilibre les unes avec les autres); la fonction de saturation présente une expression similaire, mais le terme Kd, qui correspond toujours à [L]0,5 , représente alors la constante d'équilibre apparente que l'on peut définir entre le ligand libre, la somme des différentes espèces de protéine libre et la somme des différentes espèces complexées au ligand : Kd = (Σ[protéine libre])x[L libre]/Σ[protéine complexée] Pr M.SLIMANI

33 Protéines à plusieurs sites de fixation pour un ligand :
Si une protéine possède plusieurs sites de fixation pour un ligand, ces sites peuvent être indépendants (la fixation du ligand sur un site étant indépendante de l'état de saturation des autres sites ) ou dépendants. a) Sites indépendants et équivalents : Si une protéine possède n sites de fixation équivalents, la relation d'équilibre est vérifiée au niveau des sites : [sites libres ][L]/[sites occupés] = Kd Kd = constante de dissociation microscopique ou intrinsèque. En faisant intervenir la concentration des sites totaux, qui est égale à n fois la concentration de la protéine : [sites occupés] = [sites totaux] x [L]/(Kd+[L]) = n[Pt]x [L]/(Kd+[L]) = n [Pt] Ÿ. Pr M.SLIMANI

34 V = [sites occupés]/[Pt] = n [L]/(Kd+[L]) = n ý.
La fonction de saturation de l'ensemble des sites est égale à la fonction de saturation de chacun des sites. On définit aussi V, le nombre moyen de sites occupés par protéine : V = [sites occupés]/[Pt] = n [L]/(Kd+[L]) = n ý. La concentration de ligand lié est égale à la concentration de sites occupés. Elle augmente avec la concentration de ligand libre selon une loi hyperbolique pour atteindre une valeur limite quand tous les sites sont occupés : [ligand lié] = [ligand lié]max . [L]/([Kd+[L]). [ligand lié] et [ligand lié]max sont souvent appelées B et Bmax respectivement (B vient de l'anglais "bound" qui signifie lié) : B = Bmax . [L]/(Kd+[L]). Pr M.SLIMANI

35 II Analyse des données expérimentales :
Lorsque les concentrations de ligand lié sont connues pour différentes concentrations de ligand libre, l'analyse mathématique permet de mettre en évidence que l'on est en présence d'une ou plusieurs lois hyperboliques (et donc que l'interaction implique l'existence d'un ou de plusieurs équilibres ) et de déterminer le nombre de sites de fixation et leurs constantes de dissociation. Le nombre de sites de fixation se déduit de la concentration maximale de ligand que l'on peut lier (tous les sites étant alors occupés). Si [Pt] = la concentration de protéine, est connue, on peut déterminer n, le nombre de sites de fixation par molécule de protéine. Mais on peut aussi bien déterminer un nombre de sites par cellule, ou de moles de ligand lié par mg de protéine. Pr M.SLIMANI

36 - Représentation de Klotz : 1/V = 1/n +(1/n Kd/[L]).
1) Sites équivalents : La concentration de ligand lié suit une loi hyperbolique en fonction de la concentration de ligand libre. Plusieurs méthodes d'analyse des hyperboles existent. Les méthodes de linéarisation permettent de vérifier graphiquement que l'on est en présence d'une simple hyperbole, et de déterminer les paramètres qui la caractérisent. Les deux représentations les plus couramment utilisées ont été décrites initialement pour lineariser l'expression de ([ligand lié]/[Pt]) en fonction de [L] : - Représentation de Klotz : 1/V = 1/n +(1/n Kd/[L]). Représentation de Scatchard : V/[L] = n/Kd - V/Kd. Tout paramètre proportionnel à V peut être utilisé dans ces représentations, la signification des intersections avec les axes des abscisses et des ordonnées étant modifiée. En particulier, on utilise souvent la représentation de " Scatchard" pour linéariser l'équation de [ligand lié ]en fonction de [L] : [ligand lié]/[L] = [ligand lié]max/Kd - [ligand lié]/Kd. Pr M.SLIMANI

37 2) Sites indépendants et non équivalents :
La représentation de Scatchard n'est plus linéaire, et il est très difficile de déterminer les valeurs de Bmaxi et de Kdi par des méthodes graphiques. Le principe d'une telle analyse peut se résumer ainsi : pour une concentration donnée de ligand libre, le ligand lié est la somme du ligand lié à chaque classe de sites. Dans la représentation de Scatchard, les données correspondent à la fixation sur une classe de sites s'alignent sur une droite caractéristique de la linéarisation de l'hyperbole. L'ensemble des points correspondent à une même concentration de ligand libre [L] et à différentes valeurs de [ligand lié] s'alignent, quant à eux, sur une droite passant par l'origine et de pente 1/[L]; déterminer à partir d'une représentation de Scatchard non linéaire, les paramètres de fixation sur chaque classe de sites consiste donc à définir les droites correspondent à chacune de ces classes qui permettent de retrouver la courbe originale lorsque l'on calcule, pour chaque concentration de ligand libre, la somme des concentrations de ligand lié à chaque classe de sites. Pr M.SLIMANI

38 c) Fixations spécifiques et non spécifiques :
Une fixation non spécifique est observée en général lorsque l'on étudie la fixation de ligands sur des préparations membraneuse, est définie comme une fixation sur des sites très nombreux mais de très mauvaises affinité pour le ligand. Elle s'oppose à la fixation spécifique, qui a lieu sur un nombre limité de sites et avec une bien meilleure affinité. La constante de dissociation des sites non spécifiques est très grande devant la concentration de ligand libre utilisée. Avec cette approximation, la concentration du ligand aux sites non spécifiques est proportionnelle à la concentration de ligand libre utilisé, avec le facteur de proportionnalité Knon spécifique. Lorsque l'on est en présence de fixation non spécifique et de fixation spécifique sur une seule classe de sites, la courbe de la concentration de ligand lié en fonction de la concentration de ligand libre est la somme d'une droite et d'une hyperbole : [ligand lié] = Bmax [L]/(Kd+[L]) + Knon spécifique [L]. Pr M.SLIMANI

39 Protéine + [Δ*] [Δ] en large excès …………. mesure la fixation non
L'évaluation de la fixation non spécifique se fait le plus souvent en utilisant, outre le ligand radioactif* qui se fixe avec une bonne affinité sur les sites spécifiques étudiés, un ligand non radioactif qui lui, aussi, se fixe avec une bonne affinité sur les sites spécifiques et avec une très mauvaise affinité sur les sites non spécifiques. Lorsqu'il est utilisé en large excès devant le ligand radioactif, son effet inhibiteur compétitif se manifeste seulement vis-à-vis des sites spécifiques. Protéine + [Δ*] [Δ] en large excès …………. mesure la fixation non spécifique par la R*. Lorsque le ligand R* (Δ*) est utilisé seul, la fixation observée est égale à l'ensemble de fixation spécifique et non spécifique : on l'appelle fixation totale. Pr M.SLIMANI

40 Fixation spécifique = fixation totale - fixation non spécifique
Lorsque la fixation de ligand R* est mesurée en présence du compétiteur non R* (Δ) en excès, la fixation spécifique du ligand R* devient négligeable à cause de l'effet de compétition (on dit que le ligand compétiteur "déplace" le ligand R*). La fixation du ligand R* que l'on mesure est alors égale à la seule fixation non spécifique. Fixation spécifique = fixation totale - fixation non spécifique Expériences de saturation de la liaison à l'équilibre - Notions de Kd et de Bmax : Principe: Il s'agit de mesurer la liaison spécifique à l'équilibre, lors de l'incubation de concentrations croissantes de ligand radioactif (par ex. : à 10-5 M), avec une quantité fixe de récepteur (par exemple : cellules entières exprimant des récepteurs, ou bien 10 ng d'unepréparationdemembranescellulaires Pr M.SLIMANI

41 Approche expérimentale : caractérisation d’un récepteur par technique de liaison spécifique au récepteur (ou binding) Cette technique utilise des ligands qui se définissent comme tout composé (agoniste ou antagoniste) capable de se fixer sur un récepteur. Elle permet de définir l’affinité d’un nouveau ligand pour des sites de liaison spécifiques (récepteurs), c’est à dire la capacité de fixation du ligand à son récepteur.. Cette technique n’étudie que le site de fixation du ligand et pas la réponse biologique ou pharmacologique. Il existe deux types de méthodes d’étude de la liaison du ligand au récepteur : la méthode de saturation et la méthode de déplacement.

42 Méthode de saturation A partir d’un homogénat tissulaire ou d’une préparation cellulaire ou membranaire contenant le récepteur à étudier et une concentration connue d’un ligand radiomarqué (3H , 14C , 125I sont les isotopes radioactifs les plus utilisés), il est possible de définir une liaison totale qui correspond à la somme de la liaison du ligand à son récepteur (liaison spécifique à forte affinité) et à d’autres sites de Liaison à faible affinité (liaison non spécifique). La liaison non spécifique est mesurée en présence d’une quantité de ligand non radioactif (ligand froid) suffisante pour empêcher la fixation du ligand radioactif sur ses sites spécifiques. La liaison spécifique correspond à la différence entre liaison totale et liaison non spécifique et permet de définir l’affinité du ligand pour son récepteur. Incubation ligand radioactif (L*) avec le récepteur R (par ex sur des mb) • Séparation : on élimine le marqueur libre par filtration • Mesure radioactivité du marqueur lié k1 [L*R] [L*] +[ R] k-1

43 Représentation de la liaison en fonction de la concentration initiale en ligand
Détermination de la fixation spécifique par méthode de saturation : 1. Préparation riche en récepteurs + radioligand en concentration croissante : liaison totale 2. Préparation riche en récepteurs + ligand froid en surcharge + radioligand en concentration croissante : liaison non spécifique 3. On déduit la liaison spécifique

44 [RL] = [RL*] = concentration de radioligand lié de manière spécifique
[L] = [L*] = concentration de radioligand libre. Ainsi, la représentation de [RL] (axe des ordonnées, y) en fonction de [L] (axe des abcisses, x) est une hyperbole [RL] = f ( [L] ) Pr M.SLIMANI

45 représentation de la liaison spécifique en fonction du log de la concentration initiale en ligand.
Pr M.SLIMANI

46 Figure 4: Représentation selon Scatchard : B/F = f (B).
Quantifification Relation de Scatchard : permet une détermination plus précise de KD et Bmax Ordonnée : ligand lié (L*R) / ligand libre (L*) Abscisse : ligand lié (L*R) KD = (L*x (Bmax - L*R))/L*R L*R = (L*x (Bmax - L*R))/ KD en développant et en simplifiant : L*R = (Bmax x L*) / (L*+ KD) en réarrangeant : L*R / L* = (-1 / KD) L*R + (Bmax / KD) soit lié / libre = (-1 / KD) lié + (Bmax / KD) Y = ax b Unités : Axe des x et des y : même unité : cpm ; nombre de sites / cellule ; fmol / mg de protéines.  Le Kd s'exprime en M (mol / l), souvent en nM ou pM. Le Bmax s'exprime en nombre de sites de liaison/cellule ou en fmol/mg de protéines. Figure 4: Représentation selon Scatchard : B/F = f (B). Pr M.SLIMANI

47 Expériences de déplacement de la liaison à l'équilibre - Notions d'IC50 et de Ki : Principe :
C'est la mesure de la liaison spécifique à l'équilibre, d'une concentration donnée (en général égale au Kd) en ligand radiomarqué en présence d'une concentration variable et croissante de ligand froid (par ex. : à 10-5 M). Le ligand froid entre en compétition avec le ligand radioactif pour sa liaison au récepteur, c'est pourquoi on peut parler de compétition de la liaison à l'équilibre Cette technique permet de démontrer qu'un ligand froid, se lie à un récepteur. d'étudier la liaison d'un ligand de faible affinité pour un récepteur (il est plus facile de disposer d'un ligand froid en grande quantité, que d'un ligand radiomarqué) Pr M.SLIMANI

48 Figure 5: Représentation de la liaison totale en fonction du log de la concentration en ligand compétiteur froid. Axe des y : cpm ; nombre de sites / cellule ; fmol / mg de protéines. NB : la liaison totale n'est pas égale au Bmax car la concentration en radioligand n'est pas saturante. Pr M.SLIMANI

49 100 % : liaison spécifique en l'absence de compétiteur froid.
Expériences de compétition de la liaison, à l'équilibre ( IC50 , Ki ) : Figure 6: Représentation de la liaison spécifique en fonction du log de la concentration en ligand compétiteur froid. 100 % : liaison spécifique en l'absence de compétiteur froid.  50 % : concentration en compétiteur froid qui déplace 50 % de la liaison spécifique en ligand radiomarqué ( = IC50). 0 % : liaison spécifique en présence d'un excès de compétiteur froid. Pr M.SLIMANI

50 Equation de Cheng et Prusoff :
Cheng et Prusoff ont déterminé en 1973 la relation qu'il existe entre le Kd, le Ki et l'IC50 Ki = constante de dissociation à l'équilibre pour le compétiteur froid. Kd = constante de dissociation à l'équilibre pour le ligand radiomarqué (affinité). [L] = [L*] = concentration de radioligand libre. Kd représente donc bien la concentration en compétiteur froid qui se lie à 50 % des sites récepteurs Pr M.SLIMANI

51 III- Approches expérimentales :
Mesure des concentrations de ligand lié et de ligand libre : La concentration des sites de fixation demande en général la mesure des concentrations de ligand lié et de ligand libre. Plusieurs approches expérimentales sont possibles: elles utilisent en général la séparation physique du ligand libre et du ligand lié à la protéine. Ainsi lorsque l'on étudie la fixation d'un ligand sur des protéines membraneuse, on peut centrifuger (ou filtrer) le mélange. Le ligand libre se retrouve dans le surnageant (ou le filtrat), le ligand lié dans le culot (ou le filtre). Si l'on travaille avec des protéines solubles, et que l'on étudie la fixation de petits ligands, on peut utiliser la filtration sur tamis moléculaire ou la dialyse à l'équilibre. La filtration sur une colonne de tamis moléculaire utilise les différences de migration des grosses molécules (la protéine avec ou sans ligand lié) et des petites molécules (le ligand libre). Pr M.SLIMANI

52 Dans le cas de la dialyse à l'équilibre, le ligand libre est capable de diffuser librement à travers la membrane de dialyse, alors que ligand lié à la protéine ne peut pas traverser la membrane. Une variante de cette méthode est la mesure de la vitesse de dialyse à travers une membrane: cette vitesse est proportionnelle à la [ligand libre ] dans la chambre de dialyse. La détermination de la [ligand lié] et de [ligand libre] peut se faire indirectement, en étudiant un paramètre expérimental qui varie lorsque le ligand passe de l'état libre à l'état lié. Exemple: la fluorescence d'un coenzyme libre peut être comparée à la fluorescence de ce coenzyme lorsqu'il est en présence d'une concentration saturante d'apoenzyme. Connaissant ces deux paramètres, on peut, pour différentes concentrations d'apoenzyme calculer la concentration de coenzyme libre et de coenzyme lié. Pr M.SLIMANI

53 Références -ANTONIOTTI .S, cours de biocatalyse ,2007 -BECKER H ; Eléments de biochimie : Notions d’enzymologie -BENDAVID .C,2009, Enzymes et coenzymes -CHIBRAOUI Layachi et KABBACH Wafae, Enzymologie, -COLLAS .Ph : Enzymologie théorique -CORNISH-BOWDEN .A , JAMIN.M et SAKS.V , cinétique enzymatique ,2005DELAHAYE .A, Enzymologie, -KEILLOR.J.W, Inhibitions des réactions enzymatiques ,2004 -PAPY –GARCIA.D et GARRIGUE ANTAR.L , Cinétique enzymatique -RAISONNIER .A, 2002,Enzymologie élémentaire -TOUSSAINT B., Les enzymes,2011 -WEINMAN .S et MEHUL.P , Toute la biochimie, ed. Dunod, Paris, 2004