Acides nucléiques: structure propriétés physico-chimiques

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1 Acides nucléiques: structure propriétés physico-chimiques
CHMI 2227F Biochimie I Acides nucléiques: structure propriétés physico-chimiques CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

2 Acides nucléiques Découverts en 1869 par Friedrich Meischer:
Composé acide présent dans le noyau cellulaire; Donne le nom de nucléine à ce composé; Plus tard, d’autres scientifiques déterminent que les acides nucléiques sont composés de: Phosphore Azote Carbone Oxygène Deux types d’acides nucléiques: Acide déoxyribonucléique (ADN) Acide ribonucléique (ARN) Et pis après? Kossé ça donne tout ça???? CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

3 Hershey et Chase L’expérience du Waring blender…
32P seulement dans les acides nucléiques 35S dans les protéines seulement (Met/Cys) CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

4 Nature des acides nucléiques 1. bases azotées
Il existe 5 bases azotées: Purines: Adénine Guanine Pyrimidines Cytosine Thymine Uracile CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

5 Nature des acides nucléiques 2. sucres
Deux types de sucres à 5 carbones sont retrouvés dans les acides nucléiques: Ribose (ARN) 2’Désoxyribose (ADN) Configuration des sucres: 2’ endo: C2’ au-dessus du cycle 3’ endo: C3’ au dessus du cycle CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

6 Nature des acides nucléiques 3. nucléosides
H Deoxyadenosine Lien glycosidique 1’ 9 1 Cytidine La formation d’une liaison covalente (lien glycosidique) entre le sucre et la base azotée forme un nucléoside CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

7 Nature des acides nucléiques 3. nucléosides
Purines Base DNA RNA Adénine Déoxyadénosine Adénosine Guanine Déoxyguanosine Guanosine Pyrimidines Base DNA RNA Cytosine Déoxycytidine Cytidine Thymine Déoxythymidine - Uracile Uridine CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

8 Nature des acides nucléiques 3. nucléosides
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

9 Nature des acides nucléiques 4. nucléotides
Les nucléotides sont des nucléosides portant un ou plusieurs groupes phosphates, généralement à la position 5’ du sucre; Guanosine 5’monophosphate Déoxythymidine 5’triphosphate Alpha a Beta b Gamma g CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

10 Nature des acides nucléiques 4. nucléotides
Nombre de groupes phosphates Déoxynucléotide/Nucléotide 1 Déoxyadenosine-5’-monophosphate 2 Déoxyguanosine-5’-diphosphate 3 Adénosine-5’-triphosphate CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

11 Nature des acides nucléiques 5. les polynucléotides
Les nucléotides et les déoxynucléotides forment des polymères appelés polynucléotides Les nucléotides sont liés ensemble via une liaison phosphodiester; Implique le 3’OH d’un nucléotide et le phosphate a en positon 5’ d’un autre nucléotide; L’ordre des bases dans un polynucléotide est la structure primaire ou la séquence de l’acide nucléique; Les polynucléotides ont une polarité: Extrémité 5’ : le phosphate 5’ n’est pas impliqué dans une liaison phosphodiester Extrémité 3’ : le 3’OH n’est pas impliqué dans une liaison phosphodiester; CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

12 Nature des acides nucléiques 5. les polynucléotides
a b g CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

13 Nature des acides nucléiques 6. Les règles de Chargaff
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

14 Structure des acides nucléiques 1. ADN
L’ADN est formé de deux chaînes de polynucléotides antiparallèles (vont dans des directions opposées); Les bases sont presque perpendiculaires à l’axe (inclinaison de 6o); Les bases sont enfouies à l’intérieur de la structure, avec le squelette sucre-phosphate à l’extérieur; Les deux chaînes sont maintenues ensemble via la formation de ponts H entre bases azotées: A forme 2 ponts H avec T (paire de base AT) G forme 3 ponts H avec C (paire de base GC) Cette relation A:T et G:C dicte la complémentarité des deux chaînes: La nature de la base sur un brin donne immédiatement la nature de la base sur le brin opposé; bases Squelette sucre-phosphate CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

15 Structure des acides nucléiques 1. ADN
Les deux chaînes polynucléotidiques forment une hélice droite: Environ 10 paires de bases par tour d’hélice; 3.4 Å par 34 Å par tour 20 Å de diamètre Sucre: 2’ endo Lien glycosidique: anti Présence de deux crevasses à la surface de l’hélice: Petite crevasse: faible distance entre les deux chaînes; Grande crevasse: plus grand espace entre les deux chaînes; CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 1 Å (Ångstrom) = 0.1 nm = 1 x m

16 Structure des acides nucléiques 1. ADN
Stabilité de l’hélice: Plusieurs ponts H entre les deux chaînes; 2 ponts H pour AT 3 ponts H pour GC Empilement des bases (p.ex. pile de pièces de monnaie): L’empilement de paires de bases GC est plus stable; Donc, une molécule d’ADN riche en GC sera plus stable qu’une molécule d’ADN contenant plus de AT; CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

17 Structure des acides nucléiques 2. Duplex ARN/ARN et ADN/ARN
Les molécules hybrides ADN/ARN ainsi que les duplexes d’ARN suivent les mêmes règles de base que l’ADN: Complémentarité Antiparallélisme Cependant, le 2’OH de l’ARN affecte la structure de l’hélice: Plus large: 26 Å Plus courte: 11 bp/turn Distance par paire de base: 2.6 Å Les bases sont plus inclinées (20o) Configuration des sucres: 3’endo CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

18 Structure des acides nucléiques 2. Duplex ARN/ARN et ADN/ARN
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

19 Structure des acides nucléiques
Java applets: CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

20 ADN: Absorbance Les acides nucléiques absorbent à ~260 nm (à cause des bases puriques/pyrimidiques); Généralement: les préparations d’acides nucléiques pures donnent un rapport A260/A280 d’environ1.8; Des valeurs de A260/A280 inférieures à 1.8 sont généralement indicatives de la contamination des acides nucléiques par des protéines. Pourquoi??? Petit truc: une absorbance de 1 à 260 nm donne: 50 µg / ml d’ADN 40 µg / ml d’ARN CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

21 Dénaturation de l’ADN Les acides nucléiques double brins (db) (ds) peuvent être convertis en acides nucléiques simple brins (sb) (i.e. dénaturés) de plusieurs façons: Augmentation de la température Diminution de la concentration de sel Produits chimiques: NaOH/formamide/formaldéhyde (brisent les ponts H) Inversement, l’ADN sb peut être renaturé de la façon suivante: : Diminution de la température Augmentation de la concentration en sel Ce phénomène peut être suivi par spectrophotométrie: Les acides nucléiques sb absorbent davantage à 260 nm que les acides nucléiques db: hyperchromicité; CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

22 Dénaturation de l’ADN DNA#1 DNA#2
La température à laquelle 50% de l’acide nucléique db s’est dénaturé est appelée la température de fusion (Tm); Le Tm est affecté par plusieurs facteurs: Concentration en sels: Tm augmente avec la [NaCl]; Longueur des molécules: Tm augmente avec la longueur (pour ADN < 150 pb) Contenu en G+C: Plus le contenu en GC est élevé, plus le Tm sera aussi élevé; Tm = 4 (G + C) + 2 (A+T) Quel est le Tm de la molécule d’ADN suivante: 5’GACTAGATCGATGGCTTCGATACC3’ 3’CTGATCTAGCTACCGAAGCTATGG5’ Hyperchromicité DNA#1 DNA#2 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

23 Dénaturation de l’ADN G+C-rich A+T-rich
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24 Hybridation Les acides nucléiques sb ayant des séquences complémentaires vont se renaturer lorsqu’elles seront mélangées ensemble (hybridation); ADN-ADN ADN-ARN ARN-ARN La renaturation se produira même si les deux brins ne sont pas parfaitement complémentaires; Cependant, le Tm diminuera avec le nombre de différences dans la complémentarité; Ce phénomène est très utilisé lors de l’étude des acides nucléiques: Séquençage PCR Analyse Southern Analyse Northern Analyse FISH Puces à ADN CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

25 Électrophorèse en gel d’agarose
+ - Power ADN Microscopie électronique à balayage d’un gel d’agarose (1×1 µm)  • L’agarose est un polymère poreux qui permet le mouvement des molécules d’ADN CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

26 Électrophorèse en gel d’agarose
Molécules d’ADN De longueur connue Courbe standard: Log longueur vs distance migrée Staining with ethidium bromide Le bromure d’éthidium fluoresce rouge seulement lorsqu’il s’intercale entre les paires de bases. Électrophorèse en gel d’agarose CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

27 Analyse Southern et Northern
Une sonde d’acide nucléique marquée au 32P n’est complé-mentaire qu’à une seule des molécules d’ADN présentes sur le gel Hybridation Analyse Southern: des molécules d’ADN sont séparées sur le gel et hybridées; Utilisé fréquemment pour étudier la structure des gènes; Analyse Northern: des molécules d’ARN sont séparées sur le gel et hybridées: Très utilisé pour déterminer le lieu et l’intensité de l’expression d’un gène d’intérêt. CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

28 Analyse Southern ADN génomique coupé avec
une enzyme de restriction Allèle différente des autres? CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

29 FISH Fluorescent in-situ hybridization
Le FISH est utilisé pour déterminer la position d’un gène sur un chromosome; Une sonde d’acide nucléique fluorescente et complémentaire au gène d’intérêt est hybridée à des chromosomes; CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.