La réplication de l’ADN

Présentation au sujet: "La réplication de l’ADN"— Transcription de la présentation:

1 La réplication de l’ADN
Biog6L Paule SEITE Responsable UE Thierry FERREIRA

2 Watson et Crick 1953 « Il n’a pas échappé à notre attention que l’appariement de bases spécifiques dont nous faisons l’hypothèse, suggère immédiatement un mécanisme de copie du matériel génétique »

3 3 hypothèses Watson et Crick Delbrück Coupures/jonctions

4 Expérience de Meselson et Stahl, 1958
E Coli 15NH4Cl 14NH4Cl Transfert Cl : Réplication semi-conservative

5 La réplication est un mécanisme cellulaire vital
Réplication E.coli (5x106 pb) ≈ 40 min Deux milles paires de bases à chaque seconde. L'ADN étant composé d'une dizaine de paires de bases par tour d’hélice, ce processus imprime un mouvement rotatif de rpm ! Comment ça marche? La survie d’une espèce dépend de sa stabilité génétique. Environ 1 nt modifié tous les 109 nt à chaque réplication. Pourquoi si peu d’erreurs?

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7 Quel mécanisme moléculaire permet une réplication aussi rapide et efficace de la molécule d’ADN, compte-tenu des contraintes topologiques liées à la structure en double hélice ? Différentes suggestions : Super-enroulement inverse de celui de l’hélice Hélice droite en proportion égale d’hélice gauche Remise en cause de la structure double-hélice : rubans alignés (1976) Mais Incompatibles avec les données en diffraction RX

8 Le mécanisme de réplication dépend de 2 activités fondamentales
Séparation des brins de la molécule mère Synthèse d’ADN Le mécanisme de réplication se déroule en 3 phases: Initiation Elongation Terminaison Ces activités impliquent des complexes protéiques qui agissent afin d’assurer une synthèse Progressive Coordonnée Couplée

9 Séparation des brins de la molécule mère
ou comment se soustraire des contraintes topologiques? Les Topoisomérases 30 millions de tours/ chromosome en moyenne Découverte des topoisomérases (J. Wang, 1971). Coupures temporaires permettant de passer 1 ou 2 brins de la double hélice, puis religature des brins coupés. Type Substrat Exemple IA ADN ss Topo I et III (E.Coli) Topo III (Homme Levure) IB Topo I (eucaryotes) II ADN ds Topo II (gyrase) et IV (procaryotes) Topo II et IV (eucaryotes)

10 Modélisation Topo I Cap Core subdomain II Core subdomain I Linker
Cter domain Core subdomain III

11 Mécanisme d’action de la Topo I

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13 Modélisation Topo II

14 Mécanismes d’action de la Topo II

15 Les topoisomerases : - Modifient la topologie de l’ADN mais - Ne déroulent pas l’hélice (pas de rotation) - Diminuent le nombre de tours de la molécule mère Sont impliquées dans d’autres mécanismes moléculaires - transcription - recombinaison - constituant majeur de la matrice nucléaire - structure de la chromatine - séparation des chromatides au cours de la division

16 Initiation de la réplication et protéines associées
Protéines d’initiation Hélicase Protéines SSB

17 Mécanisme de réplication chez E.Coli
Réplicon : unité d’ADN où se produit la réplication. 1 origine 1 terminaison Chromosome bactérien = 1 replicon

18 La réplication est bidirectionnelle

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20 Initiation de la réplication chez Coli
OriC Unique 245 pb Caractérisées par la présence de séquences répétées en tandem - 3 séquences de 13 nucléotides de type GATCTNTTNTTTT (AT riche) - 5 sites de liaison (TT(A/T)T(A/C)CA(A/C) A) pour dnaA dnaA est une protéine d’initiation Copies multiples associées à OriC Consommation d’ATP Transformation localisée de l’ADN superenroulé(-) en ADN simple brin ADN ds ADN ss

21 Dna A : dénaturation localisée
dnaBC : complexe de pré-amorçage Liaison de dnaB au site d’initiation Libération de dnaC (transporteuse) dnaB : Rupture des liaisons H dnaB catalyse le déroulement en présence d’ATP dnaB est une hélicase

22 Activité hélicase

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24 Les protéines SSB empêchent le réappariement des brins
Structure en feuillet b : canal autour du simple brin

25 Elongation

26 Réplication Réparation Détection des dommages
Les ADN polymérases d'Escherichia coli Enzyme   ADN polymérase I ADN polymérase II ADN polymérase III Nombre de sous-unités 1 8 Fonctions Réplication Réparation Détection des dommages Réplication Polymérisation 5'®3' + + (a) Exonucléase 3'®5' + (e) Exonucléase 5'®3' -

27 Contraintes de fonctionnement de l’ADN Pol III
1) Sens de synthèse 5’ vers 3’ 2) Pas de synthèse possible sur une molécule simple brin Amorces indispensables

28 3) La fourche de réplication est asymétrique
Brin précoce ou avancé : synthèse continue Brin tardif ou retardé : synthèse discontinue

29 Synthèse du brin avancé

30 ADN Pol III 8 sous unités a, e, θ : activité catalytique b: sliding clamp = pince 3g, d, d’ : clamp loader = attachement au brin et détachement

31 Synthèse du brin retardé

32 Polymérase de 5’ vers 3’ jamais isolée
dTTP marqué au 3H Réplication pendant très peu de temps Extraction d’ADN Analyse des ADN simples brins radioactifs fragments longs sur un brin dit précoce fragments courts sur le brin tardif

33 ARN Polymerase ou primase
Fragments d’Okasaki 3’ 5’ 3’ 5’ ARN Polymerase ou primase N’a besoin que d’une matrice Amorce ARN de 4 à 15 nt chez Coli ADN Polymerase III

34 Elimination des amorces
ADN Pol III ADN Pol I Pol III sans activité exonucléasique Ligase

35 DNA synthesis at a replication fork
4 3 1 2

36 Initiation de la réplication chez les Eucaryotes
Levure : Séquences ARS (séquences de replication autonome) ≤ 200pb, 4 sous domaines : A, B1, B2, B3 A B2 B3 B1 Reconnaissance de l’origine. Liaison ATP dépendante du complexe ORC (ori recognition complex). Stable. Liaison de ABF1 Torsion hélice Zone de fusion

37 Séquence de liaison au complexe ORC
Séquence indispensable à l’activité de l’origine Unités transcriptionnelles ou séquences régulatrices Droso :Amplification Control Element et Amplification Enhancing Region (AT rich)

38 2 cas de figure chez les Métazoaires
Origine localisée sur qques Kb (b globine) Région d’initiation où plusieurs séquences influencent l’activité de l’origine (DHFR)

39 La réplication n’est initiée qu’une fois par cycle cellulaire
Zone de compétence

40 Contrôle de l’initiation de la réplication
Origines rendues « compétentes » pour le recrutement des facteurs nécessaires à l’entrée en phase S. 2) Contrôle en fin mitose /début G1, pour 1 réplication unique à partir de chaque origine (sinon ….erreurs) 3) Liaison sur Ori de protéines ORC, qui ensuite recrutent autres facteurs pour former des complexes pré-replicatifs

41 En fin de G1 : Assemblage du complexe pré-réplicatif
1: ORC : origin recognition complex. 6 ss-unités 2: Fixation de cdc6: ATPase 3: Complexe hexamérique MCM2-7 Rôle régulateur important. Activité ATPase et hélicase Cdt-1 : Facteur de transcription

42 1: kinase cdc7 active le complexe réplicatif.
Activité dépendante du facteur Dbf4 2 : CDK2 permet l’activation de cdc45 pour l’accrochage de l’ADN polymerase. Activité dépendante des cyclines

43 Régulation des complexes pré-réplicatifs
3: En anaphase, la geminine est dégradée 4: CDT1 est libérée et permet l’association des complexes pré-réplicatifs. 1: La geminine synthétisée en G1 se fixe sur Cdt1 2: Cdt1 est bloquée pour éviter l’association de nouveaux complexes PR.

44 Elongation

45 a b d e g 5’ > 3’ - + Les ADN polymérases d'Eucaryotes (9 ou +) I
Supérieurs a b d e g Levure I IV III II mito z Sous unités 4 1 2 Localisation Noyau ? Fonction Amorçage replication Réparation replication Synthèse/lésion Polymérisation 5’ > 3’ Exonucléase 3’ vers 5’ - + 5’ vers 3’

46 (Clamp loader) se lie à l’ARN et recrute PCNA
4: Replication Factor C (Clamp loader) se lie à l’ARN et recrute PCNA 2: Replication Protein A (SSB) Polymerase switching 5: PCNA clampe Pold sur l’ADN 3: Synthèse d’une amorce hybride ARN-ADN (10nt) 6: Elongation par Pold sur brin retardé Pol e sur brin avancé 1: activité hélicase de Mcm 2-7 7: élimination de l’ARN par un complexe RNAseH/FEN(1nt)

47 Reconstitution de la chromatine
Histones restent attachées à l’ADN Addition de nouvelles histones en arrière de la fourche de réplication CAF : facteurs d’assemblage de la chromatine

48 Cas particulier Réplication des Molécules linéaires

49 ? Raccourcissement à chaque cycle de réplication
Extrémité de la molécule D’ADN 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Raccourcissement à chaque cycle de réplication 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’

50 Les télomères sont des séquences répétées (≈qques 100 aines) de petite taille (minisatellites 5’-TTAGGG-3’) situées aux extrémités des chromosomes eucaryotes. La longueur des télomères décide de la durée de vie des cellules. Après plusieurs divisions : sénescence. Cellules arrêtées dans leur cycle, puis éliminées. Sauf : cellules embryonnaires cellules souches (progéniteurs) cellules germinales

51 Longueur des télomères et nombre de réplications
Chez S. cerevisiae Chez l’homme, les fibroblastes font 60 divisions

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53 Aspect des extrémités chromosomiques dans les cellules différenciées
T-Loop

54 Élongation par recombinaison
T-Loop Cellules différenciées Forme inaccessible = closed Télomérase Élongation par recombinaison Forme accessible = open Cellules germinales Cellules souches intestinales hepatiques hematologiques