1 Les méthodes de recherche des STEC dans les aliments 5 ème journée Steak Expert 5 ème journée Steak Expert 22 juin 2011 Estelle LOUKIADIS VetAgro Sup.

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1 1 Les méthodes de recherche des STEC dans les aliments 5 ème journée Steak Expert 5 ème journée Steak Expert 22 juin 2011 Estelle LOUKIADIS VetAgro Sup Campus Vétérinaire de Lyon, LMAP/ LNR STEC Unité CALITYSS / Equipe EMSA

2 1- Rappels et définitions: que rechercher? En France Dans le monde 2- Méthodes de détection actuelles et évolution 3- Essais interlaboratoires d’aptitude (EILA) 4- Axes de recherche 2 Plan Plan Steak Expert 22 juin 2011

3 Escherichia coli STEC (gènes stx) EHEC = STEC isolé des malades E. coli O157, O26, O103, O111 et O145 AEEC (gène eae) 3 EHEC typiques majeures ! 1- Définitions: AFSSA 2010 1- Définitions: AFSSA 2010 Steak Expert 22 juin 2011

4 4 1- Définitions: Europe (EFSA, 2009) 1- Définitions: Europe (EFSA, 2009) Mais différentes définitions STEC pathogènes: ex Allemagne

5 5 1- Définitions: Position FDA 1- Définitions: Position FDA

6 1- Rappels et définitions 2-Méthodes de détection actuelles et évolution 6 Plan Plan Comment détecter les STEC pathogènes dans les aliments? Steak Expert 22 juin 2011

7 Que détecter? Comment? 7 2- Méthodes 2- Méthodes Steak Expert 22 juin 2011

8 8 2- Méthodes normalisées 2- Méthodes normalisées Steak Expert 22 juin 2011

9 Prise d’essai :25 g Enrichissement à 41,5°C Billes magnétiques recouvertes d’Ac anti-O157 STEC O157 Other VTEC NF EN ISO 16654:2001 2- Méthodes normalisées 2- Méthodes normalisées Steak Expert 22 juin 2011

10 u Utilisation des caractéristiques biochimiques de E. coli O157:H7 (Mutants!) u Résistance à la novobiocine (20 mg/l) u sorbitol u sorbitol – u  -glucuronidase u  -glucuronidase – u Résistance intermédiaire au céfixime et au tellurite 10 2- Méthodes normalisées 2- Méthodes normalisées Milieu CT-SMAC Steak Expert 22 juin 2011

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12 Pas de caractéristique biochimique commune pour les distinguer des autres E. coli ! Détection des STEC non-O157 VTEC dans les aliments? ?? 2-Méthodes de détection: évolution 2-Méthodes de détection: évolution Steak Expert 22 juin 2011

13 Comment les détecter? O26 O103 O111 O145 Autres STEC ? 2-Méthodes de détection: évolution 2-Méthodes de détection: évolution Steak Expert 22 juin 2011

14 14 2-Méthodes de détection: évolution 2-Méthodes de détection: évolution Steak Expert 22 juin 2011

15 15 2-Méthodes de détection: évolution 2-Méthodes de détection: évolution Steak Expert 22 juin 2011

16 Méthode de recherche des souches STEC considérées comme pathogènes 16 2-Méthodes de détection: évolution 2-Méthodes de détection: évolution

17 17 Si stx+ et eae+ DEPISTAGE CONFIRMATION Si un des 5 marqueurs somatiques + Détection des 5 antigènes de somatiques O157, O26, O103, O111 et O145 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement Dilution au 1/10 ème 18-24h 37°C Détection des gènes stx et eae par RT-PCR 2-Méthodes de détection: évolution 2-Méthodes de détection: évolution Steak Expert 22 juin 2011

18 18 2-Méthodes de détection: évolution 2-Méthodes de détection: évolution Steak Expert 22 juin 2011

19 19 2-Méthodes de détection: évolution 2-Méthodes de détection: évolution Steak Expert 22 juin 2011

20 20 2-Méthodes de détection: évolution 2-Méthodes de détection: évolution Contexte particulier Ex: Epidémie O104:H4 Méthode diffusée par le laboratoire communautaire de référence (ISS, Rome) et envoi de matériel de référence. http://www.iss.it/binary/vtec/cont/Lab_proc_O104_rev2.pdf Steak Expert 22 juin 2011

21 21 2-Méthodes de détection: évolution 2-Méthodes de détection: évolution Contexte particulier Ex: Epidémie O104:H4 Méthode relayée par les LNR de l’UE (+ matériel de référence) Point d’actualité et informations disponibles sur le site du LNR http://www.vetagro-sup.fr/services/espace-entreprises/%C3%A9quipements-scientifiques/plateaux- techniques/lmap Steak Expert 22 juin 2011

22 22 2-Méthodes de détection: évolution 2-Méthodes de détection: évolution Contexte particulier Ex: Epidémie O104:H4 Steak Expert 22 juin 2011

23 1- Rappels et définitions: que rechercher? En France Dans le monde 2- Méthodes de détection actuelles et évolution 3- Essais interlaboratoires d’aptitude (EILA) 4- Axes de recherche 23 Plan Plan Steak Expert 22 juin 2011

24 Organismes organisateurs: Détection d’E. coli O157 dans les aliments: - Bipea (3 campagnes/an; 3 échantillons/campagne; viande) - LGC Standards (QM) (4 campagnes/an; 1 échantillon/campagne; poudre de lait) - LCR (uniquement pour les LNR) (≈ 1 campagne/an; 3 à 10 échantillons) Détection STEC hautement pathogènes dans les aliments: - LCR (uniquement pour les LNR) (≈ 1 campagne/an; 3 à 10 échantillons) - LNR (uniquement pour les laboratoires agréés) (1 campagne/an (avec 2 nde session); 10 échantillons; viande hachée) 24 3- Essai interlaboratoires (EILA)

25 Quelques résultats… Essais organisés par le LCR (pour les LNR) 29 laboratoires participants (32 LNR) 3 échantillons de lait Détection de STEC non-O157 ( méthode = ISO 13136 ) Méthode robuste / LNR français parmi les meilleurs 25 3- Essai interlaboratoires (EILA)

26 Quelques résultats… Essais organisés par le LNR Création de 2 réseaux de laboratoires agréés Réseau O157 (23 laboratoires) Réseau STEC (19 laboratoires) Organisation de 2 EILA (3 sessions en 2010) 19 laboratoires participants + le LNR Méthode: Détection des gènes eae et stx (ST CEN/ISO 13136) Méthode robuste 26 3- Essai interlaboratoires (EILA) Steak Expert 22 juin 2011

27 1- Rappels et définitions: que rechercher? En France Dans le monde 2- Méthodes de détection actuelles et évolution 3- Essais interlaboratoires d’aptitude (EILA) 4- Axes de recherche 27 Plan Plan Steak Expert 22 juin 2011

28 28 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC 4- Axes de recherche 4- Axes de recherche Steak Expert 22 juin 2011

29 29 4- Axes de recherche 4- Axes de recherche Exemple: Taille de la prise d’essai Classiquement 25 g Augmentation de la taille de la prise d’essai? Steak Expert 22 juin 2011

30 30 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC 4- Axes de recherche 4- Axes de recherche

31 31 Méthodes: Axes de recherche Méthodes: Axes de recherche Etude de plusieurs paramètres: t°, durée, nature du milieu, nature et concentration en antibiotiques, effet matrice Inoculation expérimentale de matrices (> cultures pures!) Etude de plusieurs souches STEC différentes (effet sérogroupe, effet souches) Exemple: Enrichissement des STEC O26 dans les fromages au lait cru

32 32 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC 4- Axes de recherche 4- Axes de recherche Steak Expert 22 juin 2011

33 Méthodes: Axes de recherche Méthodes: Axes de recherche Exemple: Pertinence ajout facteurs de virulence Steak Expert 22 juin 2011

34 34 Méthodes: Axes de recherche Méthodes: Axes de recherche Marqueurs ciblés par PCR T. réel Nombre d’échantillons positifs sur 400 stx119 stx et eae68 stx, eae et [O26 O103 O111 O145 O157] 61 Associations : stx/O26/eae β 1 / fliC H11 stx/O103/eae ε / fliC H2 stx/O145/eae γ 1 / fliC H28 stx/O157/eae γ 1 / fliC H7 stx/O111/eae θ / fliCH8 19 5 3 1 0 => intérêt de la PCR en temps réel multiplex fliC pour le sérotypage moléculaire de souches isolées Etude réalisée sur 400 fromages au lait cru (technologies fromagères les plus à risque) 26 17 % 15,3 % 6,5 % 29,8 % Exemple: Pertinence ajout facteurs de virulence

35 stx + stx + et eae + Nombre d’échantillons TOTAL 164 27 2 251 32 9 415 59 11 stx + eae + et [5 sérogroupes] + 18 9 20062007 VH réfrigérées VH surgelées 14,2% 2% 2,7% stx + et [5 sérogroupes] + et variants eae associés 0 0,5%2 2 * * stx/O26/eae β 1 * Méthodes: Axes de recherche Méthodes: Axes de recherche Etude réalisée sur 415 échantillons de viandes hachées Exemple: Pertinence ajout facteurs de virulence Steak Expert 22 juin 2011

36 36 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC 4- Axes de recherche 4- Axes de recherche

37 37 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC Possé et al., 2008 4- Axes de recherche 4- Axes de recherche

38 38 Immunoconcentration bactérienne Isolement sur géloses Confirmation sur colonies Caractérisation Prise d’essai Enrichissement Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux EHEC 4- Axes de recherche 4- Axes de recherche

39 39 Méthodes: Axes de recherche Méthodes: Axes de recherche Exemple: Profils de virulence

40 40 Méthodes: Axes de recherche Méthodes: Axes de recherche Exemple: Signature de virulence ?

41 Exemple: Etude du génome complet 4- Axes de recherche 4- Axes de recherche Steak Expert 22 juin 2011

42 Exemple: Etude du génome complet 4- Axes de recherche 4- Axes de recherche Steak Expert 22 juin 2011

43 MERCI POUR VOTRE ATTENTION ! 43 Steak Expert 22 juin 2011

44 1- Rappels et définitions: que rechercher? En France Dans le monde 2- Méthodes de détection actuelles et évolution 3- Essais interlaboratoires d’aptitude (EILA) 4- Axes de recherche 5- Quelles applications envisageables? 44 Plan Plan Steak Expert 22 juin 2011

45 Utilisation d’une méthode analytique - Rappel: Règlement 2073/2005 Un critère = Microorganisme + produit + plan d’échantillonnage et ses limites + Méthode d’analyse + stade d’application + Conduite à tenir -Contrôle de l’hygiène des procédés implique une approche « de la fourche à la fourchette ». La sécurité du produits final résulte d’une série de mesures de contrôle (pas de CCP absolu). Rq: Objectif d’un CCP: prévenir, éliminer ou réduire à un niveau acceptable le risque associé à un danger microbiologique. 45 5- Applications envisageables

46 Utilisation d’une méthode analytique - Quel danger? Quel risque? Données épidémiologiques (homme/épidémies alimentaires) 46 5- Applications envisageables Plus de 500 sérotypes de souches EHEC! Classification en séropathotypes 46 Steak Expert 22 juin 2011

47 Stratégies en amont les plus stratégiques 47 5- Applications envisageables - Sources et transmission dans les élevages (aliments, abreuvoirs, déjections, mouches!) - Facteurs influençant la prévalence et le niveau de portage (saison, « super-excréteurs » (> 10 4 UFC/g de fèces), régime alimentaire, stress, …) - Moyens de contrôle (probiotiques, vaccins, utilisation de bactériophages, chlorate, sulfate de néomycine, autres additifs, traitement du fumier et des locaux…) Steak Expert 22 juin 2011

48 Stratégies à l’abattoir ! étapes critiques (ex: dépouille/ligature rectum et oesophage /éviscération/ transport) Importance des équipements (ex t° de l’eau) mais aussi du savoir faire Stratégies post-abattoir (traitement des carcasses) Stratégies analytiques: Plan d’échantillonnage/ combinaison de plusieurs méthodes/ Importance de la confirmation des résultats. 48 5- Applications envisageables Rq: Association prévalence de carcasses contaminées/transport animaux incluant des super-excréteurs (abattoir aux Etats Unis) Steak Expert 22 juin 2011

49 MERCI POUR VOTRE ATTENTION ! 49 Steak Expert 22 juin 2011