Cours de Bactériologie Faculté de Médecine de Fès

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1 Cours de Bactériologie Faculté de Médecine de Fès
Dr. Sylvestre Tigaud Laboratoire de Bactériologie Centre de Biologie Nord Hôpital de la Croix-Rousse CHU de LYON

2 Rôle du Laboratoire de Bactériologie
Dr. Sylvestre Tigaud Tel : Fax : Hôpital de la Croix-Rousse

3 Rôle du laboratoire Diagnostic bactériologique direct But : isoler et identifier la bactérie responsable de l'infection et déterminer sa sensibilité aux antibiotiques Diagnostic indirect But : mettre en évidence une réponse immunitaire spécifique

4 Diagnostic bactériologique direct 1 – Les prélèvements
Précoce, avant les antibiotiques règles d'asepsie élémentaire étiquetage correct : identité – service, nature exacte, date (heure, n°) présence d'antibiotique ? transport rapide importance de la collaboration entre le clinicien et le microbiologiste pour l'interprétation fiche de renseignements (GBEA)

5 Diagnostic bactériologique direct 1 – Les prélèvements
Pus ou liquides d'épanchements foyers infectieux ouverts (contamination par la flore commensale) ou infections fermées seringue stérile ou écouvillon (culturette) si recherche d'anaérobies  milieux de transport (Portagerm ou hémoculture anaérobie)

6 Diagnostic bactériologique direct 1 – Les prélèvements
Crachats le matin à jeun au réveil après une toilette buccodentaire effort de toux (les crachats salivaires sont à éliminer) LBA et brosse en réanimation ou pneumologie

7 Diagnostic bactériologique direct 1 – Les prélèvements
Urines toilette soigneuse de la région vulvaire ou du gland recueil du 2ème jet dans un poudrier stérile (poche autocollante chez le nourrisson) transport rapide ou stockage à 4°C ou milieu de transport avec conservateur

8 Diagnostic bactériologique direct 1 – Les prélèvements
Selles (coproculture) de préférence un fragment muqueux ou sanglant ou écouvillonnage rectal si pas de selles. renseignements cliniques : âge, voyage, antibiotiques, épidémie familiale,… Il faut bien distinguer : La coproculture standard, à la recherche de Salmonella, Shigella, Yersinia, La coproculture à la recherche de Bactéries Multi-Résistantes La coproculture à la recherche de Clostridium difficile

9 Diagnostic bactériologique direct 1 – Les prélèvements
Prélèvements génitaux avant toute thérapeutique locale (ovules, gels, crèmes) ou toilette intime prélèvement à écouvillon guidé par les signes cliniques : des ulcérations génitales des sécrétions génitales ou leucorrhées au niveau : du méat urétral, de l'orifice des glandes de Bartholin en cas de réaction inflammatoire du cul de sac vaginal ou de l'endocol utérin après mise en place du spéculum

10 Diagnostic bactériologique direct 1 – Les prélèvements
L.C.R. (Liquide Céphalo-Rachidien) C’est le prélèvement impératif en cas de méningite bactérienne, qui est une urgence absolue. transport urgent Il faut s’assurer que le laboratoire prenne le prélèvement en charge. froid interdit (car tue les Méningocoques). N.B. Classiquement, on enseigne de faire le Prélèvement avant antibiotique…. Mais le prélèvement nécessite une Ponction Lombaire ce qui entraîne des délais d’hospitalisation. Il peut être nécessaire de commencer les Antibiotiques avant le transport à l’hôpital.

11 Diagnostic bactériologique direct 1 – Les prélèvements
Hémocultures permet le diagnostic des bactériémies (passage transitoire) et des septicémies (passages répétés accompagnés de syndrome infectieux grave) indications : toutes les formes de fièvre, et aussi les hypothermies sensation de refroidissement ou frissons, prostration, hypotension prélèvements précoces avant les antibiotiques de 4 à 6 hémocultures en 48h ponction veineuse de 20 ml après asepsie rigoureuse une hémoculture = un flacon aérobie + un flacon anaérobie

12 Diagnostic bactériologique direct 2 – L’examen macroscopique
exemples : urines troubles selles liquides crachat salivaire L.C.R. limpide, hémorragique ou purulent (eau de riz).

13 Diagnostic bactériologique direct 3 – L’examen microscopique (ou examen direct)
examen à l'état frais : mobilité des germes coloration après avoir fixé le frottis bleu de méthylène Gram Ziehl examen par immunofluorescence utilisation d'anticorps (Ac) spécifiques marqués par une substance fluorescente

14 Diagnostic bactériologique direct 4 – La mise en culture
Milieu solide (gélose en boîte de Pétri) et/ou liquide (bouillon dans des tubes) Le choix des milieux est dicté par la nature des prélèvements, les renseignements cliniques et les données de l'examen direct Mise à l'étuve 24 à 48 h ou + dans certains cas (anaérobies, mycobactéries…) Culture positive le bouillon se trouble et chaque bactérie donne naissance à une colonie sur la gélose

15 Diagnostic bactériologique direct 5 – Identification des bactéries
On connaît déjà : Les caractères morphologiques : formes, groupement, mobilité, coloration (donnés par l'E.D.) Les caractères culturaux : rapport avec O2, aspect des colonies, pigmentation, odeur, … On va définir : Les propriétés biochimiques : galeries (ex : entérobactéries) Les constituants antigéniques : anticorps spécifiques (agglutination) (ex : S. aureus, Streptococcus, …)

16 Diagnostic bactériologique direct 5 – Identification des bactéries
Part croissante des techniques de Biologie Moléculaire Hybridation avec une sonde d'ADN marquée spécifique d'un gène bactérien, soit directement soit après amplification de l'ADN bactérien par PCR (Polymerase Chain Réaction) De plus en plus souvent, on utilise le séquençage moléculaire d’une « horloge moléculaire » puis on recherche cette séquence dans une base de donnée. L’horloge moléculaire la plus utilisée est le gène codant l’ARNr16S

17 Diagnostic bactériologique direct 6 – Sensibilité aux antibiotiques
Base théorique : Détermination de la CMI : Concentration Minima Inhibitrice ; c'est la plus faible concentration capable d'inhiber toute culture visible de la souche. La CMI est comparée aux deux « concentrations critiques c et C » qui correspondent aux concentrations obtenues chez l’homme. Les limites c et C sont fixées par le Comité Français de l'Anti￿iogramme ou le N￿CLS

18 Diagnostic bactériologique direct 6 – Sensibilité aux antibiotiques
Bactérie résistante  CMI > C CMI plus élevée que les concentrations d'antibiotiques obtenues in vivo ; le traitement ne sera pas efficace Bactérie sensible CMI < c CMI nettement inférieure aux concentrations obtenues in vivo ; le traitement peut être efficace Bactérie intermédiaire c<CMI<C zone d'incertitude ; la bactérie peut être atteinte en augmentant la posologie Quotient inhibiteur : rapport entre concentration in vivo et CMI ; plus il est élevé, plus le traitement sera efficace (QI > 8)

19 Diagnostic bactériologique direct 6 – Sensibilité aux antibiotiques
Antibiogramme (en pratique la mesure des CMI est réservée à des cas particuliers) Diffusion en milieu solide : méthode des disques (la mesure du diamètre d'inhibition reflète la valeur de la CMI) lecture automatisée désormais possible Dilution en milieu liquide : systèmes automatisés ; la lecture est automatisée et informatisée

20 Exemple d’un antibiogramme sur Acinetobacter

21 Diagnostic bactériologique direct 6 – Sensibilité aux antibiotiques Bactériostase et CMI
La bactériostase est l'arrêt de la multiplication du germe, qui reste vivant, et donc susceptible de re-prendre sa multiplication si les conditions se modifient. La CMI, concentration minimale bactériostatique, est la plus faible concentration d'un antibiotique donné qui inhibe toute croissance visible en 24 heures.

22 Diagnostic bactériologique direct 6 – Sensibilité aux antibiotiques Bactéricidie et CMB
La bactéricidie est la mort du germe, définitivement incapable de reprendre sa multiplication. La CMB, concentration minimale bactéricide, est la plus faible concentration d'un antibiotique donné qui ne laisse survivre que 1/10000 après 24 heures de contact.

23 Diagnostic bactériologique direct 6 – Sensibilité aux antibiotiques Bacteriostase et Bactéricidie
Pas d’AB Bacteriostase Bactericidie

24 Diagnostic bactériologique direct 7 - Techniques sans culture
La bactériologie traditionnelle est en défaut chaque fois que : La culture est impossible (Treponema pallidum, Mycobacterium leprae…. Traitement aux antibiotiques préalable) La culture est trop complexe (Chlamydia trachomatis) La culture est trop lente par rapport à l’urgence (Mycobacterium tuberculosis, mais aussi Neisseria meningitidis) On utilise alors des techniques immunologiques (Recherche d’antigènes solubles dans le sang, l’urine ou le LCR) Mais la vraie solution est représentée par l’Amplification génique par PCR.

25 Diagnostic bactériologique direct 7 - Techniques sans culture
L’Amplification génique par PCR permet de multiplier un gène bactérien un grand nombre de fois (jusqu’à 240). Ce gène devient facile à détecter et à étudier. On peut soit utiliser l’amplification d’un gène très spécifique d’une espèce (par exemple Nuclease du Staphylococcus aureus), Soit utiliser l’amplification d’une « Horloge Moléculaire » de type ARNr16S qu’il faut ensuite séquencer : c’est le principe de la « PCR universelle »

26 Diagnostic bactériologique direct 7 - Techniques sans culture
L’avenir ? Probablement l’utisation de « DNA-chips » c’est à dire de dispositifs permettant de reconnaître en une fois de nombreuses séquences génétiques, à la fois d’identification bactérienne et virale, et de sensibilité aux antimicrobiens. Ce sera la responsabilité de votre génération que d’apprendre à utiliser ces outils !!!

27 Diagnostic bactériologique indirect
Les bactéries expriment des antigènes (Ag) Les Ag induisent une réponse immunitaire spécifique Réponse humorale : apparition d'anticorps spécifiques sérodiagnostic Réponse cellulaire : apparition d'une hypersensibilité de type retardé hypersensibilité retardée