Génomique fonctionnelle Application des Puces à ADN en Microbiologie

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1 Génomique fonctionnelle Application des Puces à ADN en Microbiologie
BORDI Christophe  : Tel

2 Qu'est-ce que la génomique ?
Définition: La génomique vise à dresser un inventaire de l'ensemble des gènes d'un organisme (génome), puis vise à comprendre comment les gènes contribuent de façon individuelle et collective à gérer les fonctions physiologiques de l’organisme. Génome - Séquence ADN des ou du chromosomes - Inventaire des gènes (annotation) - Recherche de séquences répétées génomique Post-génomique - Fonction des gènes (annotation fonctionnelle) - Leurs relations pour gérer les fonctions physiologiques de l’organisme

3 Techniques misent en place en génomique fonctionnelle
Définition: La génomique vise à dresser un inventaire de l'ensemble des gènes d'un organisme (génome), puis vise à comprendre comment les gènes contribuent de façon individuelle et collective à gérer les fonctions physiologiques de l’organisme. génomique Application des Puces à ADN en Microbiologie

4 Application des Puces à ADN en Microbiologie
Les puces à ADN est l’un des l’outil le plus abouti de la génomique qui vise à étudier la séquence et l’expression des génomes Identification des gènes impliqués dans un processus biologique la mesure du niveau d'expression de tous les gènes d'un génome : le transcriptome Identification des réseaux de régulation et comparaison aux autres espèces Bactériennes (génomique comparative) Microévolution d’une espèce dans le temps et dans l’espace Polymorphisme des populations bactériennes

5 Identification des gènes impliqués dans un processus biologique

6 Identification de gènes impliqués dans un processus biologique
Actuellement la fonction de la majorité des gènes d’un organisme reste encore inconnue ou partiellement comprise Escherichia coli qui est depuis plus longtemps l’organisme le plus étudié à plus de la moitié de ses gènes qui a encore une fonction inconnue Un moyen d’identifier la fonction des gènes peut être une analyse de leur expression : quand interviennent-ils ? Dans quelles conditions ? - Exemple : La résistance des bactérie face aux antibiotiques. Qu’elles sont les gènes impliqués dans la résistance de E. coli face à l’ampicilline ?

7 Principe d’une expérience de puces à ADN
Pour identifier les gènes spécifiquement contrôlés par l’ajout de l’ampicilline dans le milieu on va comparer le transcriptome d’une bactérie ayant poussée en présence d’ampicilline a une bactérie ayant poussée en absence d’ampicilline Condition de contrôle Ampicilline Extraction des ARN Marquage des ADNc Révélation Hybridation Hybridation non-compétitive + Ampicilline Condition de test

8 Hybridation compétitive
- Dans les expériences de puces à ADN utilisant une hybridation compétitive, chacun des échantillons (condition d’expérience) est retro-transcrit séparément avec une fluorophore différents (cyanine 3 ou cyanine 5) sur des puces différentes - Les deux sondes sont mélangées et hybridées sur la même puce à ADN Condition de contrôle - Ampicilline Cy3 Extraction des ARN Marquage des ADNc Hybridation Cy5 + Ampicilline Condition de test - L’hybridation compétitive est utilisée uniquement avec les lames de verre

9 Salmonella Salmonella sont des entérobactéries bactéries à Gram négatifs, mobiles, aéro-anaérobies facultatives Quatre sérotypes de salmonella provoquent une maladie spécifique chez l’homme. S. typhi agent étiologique de la fièvre typhoïde S. paratyphi A S. paratyphi B S. paratyphi C agent étiologique de la fièvre paratyphoïde Les germes pénètrent par voie digestive, traversent la muqueuse intestinale et envahissent le tissu lymphoïde pré-intestinal. De là, le germe passe avec la lymphe dans la circulation, ce qui entraîne un état septicémique. Les salmonelle échappent au système immunitaire en tuant les macrophages en charge de les éliminer

10 Mode d’action du macrophage
Bact 1- Les bactéries sont phagocytées par le macrophage 1 Phagosome 2 Bact 2- Les bactéries sont enveloppées dans un vacuole: le phagosome lysosome 3 3- Les vésicules de le phagosome vont fusionnées avec, qui contiennent des hydrolases acides, qui fonctionnent à un pH acide Bact Phagolysosome 4 4- Les hydrolases dégradent les bactéries Golgi Bact 5- Les résidus de bactéries sont éliminés 5 Vacuole digestive Noyau Bact

11 Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella
Phagolysosome Noyau Golgi Phagosome lysosome Sal SCV 1 2 4 3 5 1- Les salmonelles sont phagocytées par le macrophage 2- Les salmonelles sont enveloppées dans un vacuole: le phagosome 3- Les salmonelles bloquent la fusion des vésicules de lysosome au niveau du phagasome empêchant ainsi la constitution du phagolysosome 4- Les salmonelles vont modifier le contenu du phagosome afin de le rendre moins hostile en détournant des vésicules du golgi (nutriment + neutralisation du pH). La vésicule prend le nom de Salmonella-containing vesicle (SCV) 5- Les salmonelles tuent le Macrophage et sont libérées dans le milieu extérieur

12 Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella
1- Les salmonelles sont phagocytées par la cellule intestinale 1 5 Sal 2 Sal 2- Les salmonelles sont enveloppées dans une vacuole lysosome 3 SCV Sal Sal Sal Sal 4 3- Les salmonelles bloquent la fusion des vésicules de lysosome empêchant ainsi la constitution de l’endosome Précose Sal Endosome précose 4- Les salmonelles vont modifier le contenu de la vésicule afin de le rendre moins hostile en détournant des vésicules du golgi (nutriment + neutralisation du pH). La vésicule prend le nom de Salmonella-containing vesicle (SCV) lysosome Golgi Endosome tardif 5- Les salmonelles tuent la cellule intestinale et sont libérées dans le milieu extérieur Noyau

13 Conditions d’expérience pour l’étude du transcriptome
Il serait intéressant de regarder le profil du transcriptome de la bactérie au cours de ce type d’infection Cela permettra: - L’identification des gènes impliqués dans la virulence de salmonella et proposer des cibles thérapeutiques - Assigner des fonctions potentielles à certains gènes de fonction inconnue - Avoir une vision mécanistique, dynamique et évolutive de la réponse bactérienne au cours de l’infection

14 + extrait de macrophage
Conditions d’expérience pour l’étude du transcriptome Salmonelle + extrait de macrophage Cy3 Extraction des ARN Marquage des ADNc Hybridation Cy5 Salmonelle dans les macrophages Le problème: La concentration en ARNm procaryote est faible et de plus mélangée avec l’ARN eucaryote

15 La méthode SCOTS SCOTS: Selective capture of transcribed sequences
Extraction de l’ARN ARN proc 1- Extraction de l’ARN total (Eucaryote et procaryote) ARN euca Conversion en cDNA 2- Conversion de l’ARN en ADNc a l’aide d’amorces aléatoire modifiées avec une séquence spécifique de 20 nt environs en 5’ ADNc euca ADNc proc B B 3- Séparation de l’ADNc bactérien de l’ADNc eucaryote par capture sélective avec l’ADN génomique de la bactérie Enrichissement Par PCR B Capture sélective SA 4- purification du complexe ADNc/ADN génomique (biotine /strepavidine) SA 6- Amplification de l’ADNc par PCR PCR

16 Mesure de l’enrichissement par la méthode SCOTS
On mesure l’enrichissement en ARN procaryote à chaque tour par hybridation sur puce à ADN Nb gènes détectés On arrête l’enrichissement lorsque l’on peut détecter un nombre significatif de gènes

17 Résultats SCV On observe que le transcriptome de
Sal 1 Phagosome 2 Sal lysosome 3 SCV Sal Sal Sal Sal 4 Sal Phagolysosome Golgi On observe que le transcriptome de salmonella évolue au cours du temps (réponse adaptative à l’environnement) Noyau

18 Problématique de ceux type d’études

19 Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella
1- Les salmonelles déclanchent leur propre phagocytose grâce au système de sécrétion de type 3 T3SS (Sp2) 1 5 Sal Phagosome 2 Sal 2- Les salmonelles sont enveloppées dans une vacuole: le phagosome lysosome 3 SCV Sal Sal 3- Les salmonelles bloquent la fusion des vésicules de lysosome grâce au T3SS (Sp2) et modifie le transport de plusieurs ions dont le fer Sal Sal 4 Sal Phagolysosome 4- Les salmonelles vont modifier le contenu du phagosome afin de le rendre moins hostile en détournant des vésicules du golgi grâce au T3SS (Sp2) Golgi 5- Les salmonelles tuent le macrophage et sont libérées dans le milieu extérieur Noyau

20 Conclusions et remarques
Grâce à l’utilisation des puces à ADN dans la comparaison de profil de transcription on peut : - Identifier des gènes impliqués dans la virulence de salmonella et proposer des cibles thérapeutiques - Assigner des fonctions potentielles à certains gènes de fonction inconnue - Avoir une vision mécanistique, dynamique et évolutive de la réponse bactérienne au cours de l’infection C’est déjà bien mais très incomplet Le problème ici c’est que l’on a qu’une vision globale de l’expression des gènes mais on a aucune idée du réseau qui contrôle quoi et comment - Quels sont les réseaux de régulation et les protéine qui y sont impliqués ? - Quels gènes dépendent de quels réseaux ?

21 Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella
- Quels sont les réseaux de régulation et les protéine qui y sont impliqués ? - Quels gènes dépendent de quels réseaux ?

22 Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella
- Quels sont les réseaux de régulation et les protéine qui y sont impliqués ? - Quels gènes dépendent de quels réseaux ?

23 Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella
- Quels sont les réseaux de régulation et les protéine qui y sont impliqués ? - Quels gènes dépendent de quels réseaux ?

24 Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella
- Quels sont les réseaux de régulation et les protéine qui y sont impliqués ? - Quels gènes dépendent de quels réseaux ?

25 Identification des réseaux de régulation génétique

26 Détection de l’environnement par les microorganismes
- Exemple sur la régulation de la capture du fer chez les bactéries pathogènes

27 Mécanisme de régulation de la voie Fur
- Présence d’un forte concentration de fer Périplasme MI Cytoplasme Fer Fur Fur Box Le répresseur Fur est complexé à deux atomes de fer qui lui donne une forte affinité pour l’ADN. Il se fixe sur l’ADN au niveau d’une séquence appelée Fur box et réprime l’expression des gènes qu’il contrôle

28 Mécanisme de régulation de la voie Fur
- En carence en fer Périplasme MI Cytoplasme Fur Fur Box Le répresseur Fur n’est plus complexé à deux atomes de fer.

29 Mécanisme de régulation de la voie Fur
- En carence en fer Périplasme MI Cytoplasme Fur Fur Box Le répresseur Fur n’est plus complexé à deux atomes de fer et perd sont affinité pour l’ADN

30 Mécanisme de régulation de la voie Fur
- En carence en fer Périplasme MI Cytoplasme Fur Fur Box ARNm Les gènes cibles de la protéine Fur sont exprimés et permettent la capture du fer libre « the iron War »

31 Les approches misent en place pour l’identification des réseaux
- Comparaison de profil de transcription d’une souche sauvage contre un mutant du régulateur Fur en condition de carence en fer - Approche très limitée car risque important de faux positif lié au cascade de régulation et au manque de fer -Recherche de la séquence de la fur box sur le génome - Approche peu efficace car le motif de fixation est souvent « complexe » et mal maîtrisé par manque de séquence à aligner. Cela conduit souvent à un grand nombre de faux positif - Approche pas applicable au nouveau régulateur dont la séquence de fixation n’est pas caractérisée - La méthode de Chromatin ImmunoPrecipitation on Chip (abrégée ChIP on chip) - Approche global qui va permettre d’identifier toutes les régions de l’ADN qui fixent un régulateur

32 Principe du Chip-chip La méthode de Chromatin ImmunoPrecipitation on Chip (abrégée ChIP on chip) permet l'étude des protéines interagissant avec l'ADN. Il s'agit d'une combinaison de la technique de Chromatin Immunoprecipitation avec la méthode des puces à ADN. Ici seuls les gènes dont les régions régulatrices fixent la protéine vont donner un signal sur la puce (on ne voit que les régulations directes)

33 Application du Chip-chip sur le régulon Fur chez H. pylori
Les auteurs vont chercher à identifier les gènes qui sont sous le contrôle direct du régulateur Fur Pour cela ils réalisent 2 conditions d’expériences différentes Souche WT + fer Souche Dfur + fer

34 Application du Chip-chip sur le régulon Fur chez H. pylori
La première étape d’une expérience de Chip on chip consiste à faire un cross link du complexe ADN/régulateur Il faut donc rechercher le moment optimum pour former le complexe Le moment optimum est entre une DO De 0.9 et 1.1

35 Application du Chip-chip sur le régulon Fur chez H. pylori
175 gènes semble être sous le contrôle direct du régulateur Fur (on ne voit pas les indirectes d’où intérêt de combiner avec le transcriptome)

36 Application du Chip-chip sur le régulon Fur chez H. pylori
Grâce à l’utilisation du Chip on chip on peut identifier d’un seul coup l’ensemble des gènes que contrôle un régulateur Grâce à l’utilisation du Chip on chip on peut donc définir des réseaux de régulation Fur Fur box

37 Application du Chip-chip sur le régulon Fur chez H. pylori
La matrice de poids/position est assez Fiable (robuste) dans ce cas car générée à partir de plus de 175 séquences Génomique comparative

38 Identification des réseaux de régulation génétique et
Génomique comparative

39 La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF
Cas de sigma E - Absence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma Pas d’expression des gènes sous le contrôle du facteur sigma

40 La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF
- Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma

41 La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF
- Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma

42 La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF
- Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma

43 La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF
- Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma

44 La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF
- Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma

45 La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF
- Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme ARN polymérase Expression des gènes sous le contrôle du facteur sigma

46 Structure d’un promoteur
Il comprend au moins deux boites: - La boite -10 au TATA box - La boite -35 L’espacement entre les deux boites est assez conservé ( 17 nt pour sigma 70)

47 (E.coli K12+surexpression de sigma E)
Identification des gènes contrôlés par le facteur sigma E Objectif: Identifier de manière globale les gènes sous le contrôle direct du facteur sigma E Méthode employée: Étude du transcriptome Les conditions d’expérience Cy3 Cy5 Marquage des ADNc Extraction des ARN Hybridation Condition de test (E.coli K12+surexpression de sigma E) Condition de contrôle (E.coli K12)

48 Identification des gènes contrôlés par le facteur sigma E
- Évolution de la transcription au cours du temps Avec 4 expériences pour chaque temps - Méthodes d’analyse: Méthodes de normalisation: Lowess Identification des gènes significativement induit: T-test - Résultats: 96 gènes régulés par sigma E regroupés dans 50 TU (transcription unit) Sur les 50 TU: 42 induites (rouges) et 8 réprimées (vert) Quels sont les risques de cette approche ?

49 Identification des gènes contrôlés par le facteur sigma E
- Sur les 42 TU identifiées ils montrent que seulement 28 sont sous le contrôle direct du facteur sigma E - De plus pour chacune des 28 TU il détermine le +1 de transcription par RACE PCR

50 Résultats

51 Création des matrices de poids-positions
+1 Il comprend au moins deux boites: - La boite -10 ou TATA box - La boite -35 L’espacement entre les deux boites est assez conservé (17 nt pour sigma 70) Alignement des 28 séquences + 31 promoteur déjà décrit (centrage sur le +1) +1 ATACATAGATGACTCGTACGTAGCTCGATCGCTAGCTA TGCTGCTAGCTGTCAGCTCGATCGCTAGCTCATCGCTA TCGCATCGCTAATCGCTACGCTAACTCGATCGATCGAT

52 Création des matrices de poids
+1 Alignement des 28 séquences + 31 promoteur déjà décrit (centrage sur le +1) +1 ATTACCAGCGATCCATCGATCATCATACATAGATGACTCGTACGTAGCTCGATCGCTAGCTA TGACGCAACGTTCGGACTTTCGAATGCTGCTAGCTGTCAGCTCGATCGCTAGCTCATCGCTA GGATAATCGATCGATACGTACGATTCGCATCGCTAATCGCTACGCTAACTCGATCGATCGAT Matrice -35 Matrice -10 Recherche de la matrice -10 avec Wconsensus Recherche de la matrice -35 avec Wconsensus

53 Les matrices de poids -10 et -35
- Résultas +1 ATTACCAGCGATCCATCGATCATCATACATAGATGACTCGTACGTAGCTCGATCGCTAGCTA TGACGCAACGTTCGGACTTTCGAATGCTGCTAGCTGTCAGCTCGATCGCTAGCTCATCGCTA GGATAATCGATCGATACGTACGATTCGCATCGCTAATCGCTACGCTAACTCGATCGATCGAT Matrice -35 Matrice -10

54 Deux autres matrices - Afin de mieux définir le promoteur d’autres motifs sont localisés +1 ATTACCAGCGATCCATCGATCATCATACATAGATGACTCGTACGTAGCTCGATCGCTAGCTA TGACGCAACGTTCGGACTTTCGAATGCTGCTAGCTGTCAGCTCGATCGCTAGCTCATCGCTA GGATAATCGATCGATACGTACGATTCGCATCGCTAATCGCTACGCTAACTCGATCGATCGAT Matrice -35 Matrice -10 2 A/T conservés -48/-49 et -57/-58 Matrice +1 start Matrice A/T rich

55 Deux autres matrices - Afin de mieux définir le promoteur la distance entre les motifs est calculée +1 ATTACCAGCGATCCATCGATCATCATACATAGATGACTCGTACGTAGCTCGATCGCTAGCTA TGACGCAACGTTCGGACTTTCGAATGCTGCTAGCTGTCAGCTCGATCGCTAGCTCATCGCTA GGATAATCGATCGATACGTACGATTCGCATCGCTAATCGCTACGCTAACTCGATCGATCGAT Matrice -35 Matrice -10 A B C A B C

56 Conclusion - Un promoteur sigma E peut être défini par plusieurs paramètres - Quatre matrices de poids - Trois distances entre les matrices Au final seulement 39 passent le test ……

57 Bilan des résultats de prédiction
51 promoteurs sigma E Sensibilité de 76 %

58 Bilan des résultats de prédiction
Grâce à la définition d’une matrice de poids fiable on peut prédire un réseaux de régulation sE Promoteur Sigma E Cependant le danger de cette approche est la présence dans le jeu de séquence de faux positif qui entraînera une réduction de la robustesse du motif Génomique comparative

59 Matrice et autres génomes
- L’idée est : le système de prédiction peut-il prédire le promoteur sigma d’autres bactéries proches ? - Sélection de neuf bactéries De nombreux gènes orthologues sont régulés par sigma E chez les différentes bactéries

60 Fonction régulée dans les différents génomes
Liste des orthologues présentent dans les neuf bactéries Ensemble des gènes impliqués dans la structure de la paroi cellulaire Core gene set Une partie du régulon de Sigma E est conservé au sien d’espèce « proche »

61 Fonction des autres gènes chez les différentes bactéries
Implication dans la régulation de la virulence ……

62 Conclusion et résumé - Les auteurs ont crée un système de matrice de poids afin d’identifier les promoteurs dont l’expression est sigma E dépendante Identification des gènes contrôlés par sigma E par transcriptome Définition des caractéristiques du promoteur (4 matrice de poids et des distances entre les matrices) Méthode efficace avec 76 % de sensibilité - Les auteurs ont utilisé leur système pour identifier les gènes régulés par sigma E chez neuf autres organismes proches Identification d’un core gene chez les différentes bactéries impliquées dans le maintient de l’intégrité de la paroi bactérienne Supposition (contestable) que les autres gènes puissent être impliqués dans la régulation de la virulence

63 Poussons le concept de génomique comparative plus loin
On peut identifier assez facilement un ou plusieurs réseaux de régulation au sein d’un même organisme cependant ces réseaux de régulation peuvent influencer les un les autres

64 Contrôle des chaînes respiratoires chez E. coli
Chez E. coli le choix du substrat respiratoire le plus énergétique dépend de l’action concertée de plusieurs réseaux de régulation O2 > Nitrate/Nitrite > TMAO> DMSO > Fumarate

65 Prédiction du contrôle des chaînes respiratoires chez d’autres espèces
E. coli Yersinia pestis Pasteurella Vibrionaceae Grâce aux matrices de poids de chaque régulateur on peut prédire les influence des régulateurs entre eux

66 Prédiction du contrôle des chaînes respiratoires chez Yersinia pestis

67 Prédiction du contrôle des chaînes respiratoires chez Pasteurella

68 Prédiction du contrôle des chaînes respiratoires chez Vibrionaceae
Intérêt

69 Application des Puces à ADN en Microbiologie
Les puces à ADN est l’un des l’outil le plus abouti de la génomique qui vise à étudier la séquence et l’expression des génomes Identification des gènes impliqués dans un processus biologique la mesure du niveau d'expression de tous les gènes d'un génome : le transcriptome Identification des réseaux de régulation et comparaison aux autres espèces Bactériennes (génomique comparative) Microévolution d’une espèce dans le temps et dans l’espace Polymorphisme des populations bactériennes

70 Microévolution d’une espèce dans le temps et dans l’espace

71 Puce à ADN tous les gènes d’une même espèce
Application des Puces à ADN en microévolution Une souche bactérienne non pathogène peu devenir pathogène par acquisition de gènes supplémentaires à partir d’un autres organismes On peut identifier le réorganisation de génome par l’utilisation des puces à ADN Pour cela on va construire une puce à ADN qui contient si possible tout les gènes des différentes souches séquences d’une même espèce Exemple 3 espèces pseudomonas aeruginosa séquencée: PAO1 PA7 et PA14 (biovar) On va hybrider d’autres souches non séquencées pour avoir une idée des gènes qu’elle possède Souche à tester Puce à ADN tous les gènes d’une même espèce Extraction de l’ADN Marquage Hybridation Hybridation ADN-ADN

72 Application des Puces à ADN en microévolution
Liste des gènes Absent Présent Souches tester

73 Application des Puces à ADN en microévolution cas de Yersinia pestis
Yersinia pestis est l’agent ethnologique de la peste Plusieurs biovars de Yersinia pestis sont actuellement séquencé: antiqua (4367 gènes), mediaevalis (4142 gènes), orientalis (4083 gènes) Ces trois biovars sont responsables des 3 majeurs pandémies de peste - Biovar antiqua La peste Justinienne apparue en 571, origine Éthiopie - Biovar mediaevalis La peste noire apparue en 1334 en Chine - Biovar orientalis La peste orientale apparue en 1894 à Hong Kong On construit une puce ADN tous les gènes des 3 biovars

74 Application des Puces à ADN en microévolution cas de Yersinia pestis
La peste sévit encore de nos jours dans plusieurs pays dont la chine On va prélever des souches de chacun des foyers et on les hybride sur une puce

75 Application des Puces à ADN en microévolution
cas de Yersinia pestis

76 Application des Puces à ADN en microévolution
cas de Yersinia pestis