DISTRIBUTION THEORIQUE DE L’ADN

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2 DISTRIBUTION THEORIQUE DE L’ADN
G 2 , M 2 S 1 G o , G 1 G o , G 1 T e m p s 2 C N Chez l’Homme 2c = 7,18 picogrammes ADN/noyau G 1 Toutes les cellules étant génétiquement semblables Elles se distribuent en un pic G1 infiniment mince 4 C G2, M S ADN 1 2

3 DISTRIBUTION EXPERIMENTALE DE L’ADN
2 C 4 G o , 1 S G2, M T e m p s M ADN N Les erreurs expérimentales (coloration hétérogène, erreurs de mesures, fluctuations de l’électronique…) entachent Le pic G1 qui prend l’allure d’une distribution Normale…

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5 LA METHODE PROSPECTIVE DE VINDELOV
Cellules µl de tampon stockage -80°C citrate et diméthylsulfoxyde µl Solution A: Nonidet P40 Trypsine Spermine 10 minutes µl Solution B: Inhibiteur de trypsine Ribonucléase A 10 minutes µl Solution C: Iodure de propidium 15 minutes FACS © Vindelov et al, 1983

6 LA METHODE RESTROSPECTIVE DE HEDLEY
SECTION S > 50 µm BLOC DE PARAFFINE DEPARAFFINAGE: 14 Heures. DIGESTION, COLORATION: 1 heure. LA METHODE RESTROSPECTIVE DE HEDLEY XYLOL ETHANOL EAU PEPSINE FILTRATION, CENTRIFUGATION PI, RNAse FACS: 1 minute AGITATEUR TUMEUR FIXEE AU FORMOL

7 COEFFICIENT DE VARIATION DU PIC G1
Le pic G1 est statistiquement une courbe de Gauss (ou Student T) La largeur du pic G1 donne une estimation de la précision des mesures S Cette estimation est quantifiée par le rapport de l’écart-type S à la position moyenne X du pic Ce rapport S / X est le COEFFICIENT DE VARIATION N 4 C G2, M S ADN 300 6 X

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9 DNA : Toujours échelle Linéaire
Gain et / ou PMT voltage trop petits 50 100 150 200 250 Gain et / ou PMT voltage optimisés 50 100 150 200 250 2C 4C

10 CYTOPHOTOMETRIE, Casperson 1948: Aneuploïde TUMEUR
2 A Aneuploïde TUMEUR 1 , 6 1 QUANTIFICATION DE L'ADN COLORE 1 2 4 3 PAR LA METHODE DE FEULGEN 2 4 1 8 1 2 6 La majorité des tumeurs (60-80%) présentent des anomalies importantes 2 4 6 8 1 8 1 6 2 4 3 dans la teneur moyenne en ADN. 1 C Diploïde TISSU SAIN Ces anomalies peuvent être mises en relation avec un mauvais pronostic 1 2 6 , 9 4 8 3 6 2 4 1 2 2 4 6 8 1 8 1 6 2 4 3

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13 CV% = 100 (S / X) D A: s2 s1 B: X2 X1 Le coefficient de variation:
Au delà de 8-10%, toute mesure de DNA est interdite D A: CV% > 10 s2 s1 B: CV% = 2 X2 X1 CV% = 100 (S / X)

14 Trajectoire homogène: petit CV% Trajectoire erratique: grand CV%
Injection lente: MOINS de 100 noyaux /sec Injection rapide: PLUS de 1000 noyaux /sec B Injecteur Gicleur Une cellule Laser Veine porteuse: mince large Trajectoire homogène: petit CV% Trajectoire erratique: grand CV%

15 Le diamètre de la veine porteuse
dépend exclusivement des conditions Hydrodynamiques: Elle peut très bien être PLUS MINCE que les cellules, qu’elle guide alors comme un fil de collier de perles. Liquide de gainage, injecté très rapidement Veine porteuse TRES mince, injectée à Vitesse très lente

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18 TUMEUR A ADN MULTIANEUPLOIDE (MOSAIQUE)
. TUMEUR A ADN MULTIANEUPLOIDE (MOSAIQUE) (Carcinome encapsulé de la glande cortico-surrénale) A B 1 , 4 5 1 , 2 , 8 8 4 C 2 C G 2 M S S t 2 C 4 C C o n t e n u e n A D N D i f f u s i o n o r t h o g o n a l e ( S S C )

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20 La nécessité de références pour désigner le pic 2C

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22 comment savoir si l’unique pic G1 est diploïde ou non ?
Populations pures: comment savoir si l’unique pic G1 est diploïde ou non ? 2C 4C G1 Tumeur Diploïde ??? Le déplacement vers la droite du pic G1 Peut être dû: -à une authentique valeur ADN supérieure - à une modification du PMT /voltage/gain - à une différence de qualité du fluorochrome. G2M S G1 Tumeur Hypotétraploïde ??? G2M S

23 HEMATIES DE TRUITE ET DE POULET: 2 REFERENCES INTERNES
P vaut 25% de 2C humain T vaut 80% de 2C humain Le rapport des positions P/T peut être rendu constant afin de rendre comparable toute échelle d’ADN, d’un jour à l’autre sur le même cytomètre…. …d’un laboratoire à l’autre, sur des cytomètres différents. P et T doivent être mélangés aux cellules étudiées AVANT la coloration ADN G1 Tumeur Diploïde G2M S G1 Tumeur Hypotétraploïde G2M S

24 INDICE DE PLOIDIE (Index d'ADN)
- ISOLEMENT DES NOYAUX - AJOUTE DE 2 REFERENCES INTERNES DE FLUORESCENCES CONNUES 1) Hématies de poulet 2) Hématies de truite - COLORATION DES ADN A L'IODURE DE PROPIDIUM - DETERMINATION AU FACS DE LA DISTRIBUTION DE L'ADN - LA LOCALISATION DU PIC Go/G1 NORMAL EST DETERMINEE GRACE AUX REFERENCES. - INDEX D'ADN = POSITION DU PIC Go/G1 DE LA POPULATION ANORMALE POSITION DU PIC Go/G1 DE LA POPULATION NORMALE

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26 CYTOMETRIE EN FLUX ET ANALYSE D'IMAGES: DEUX APPROCHES COMPLEMENTAIRES
2 4 6 8 1 3 C B D A , 7 9

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28 LE PROBLEME DE LA PORTION CACHEE DE LA PHASE S
Les pic G1 et G2 sont statistiquement une courbe de Gauss Écart-type Une cellule G1 est statistiquement classée en 2C = X +/- écart type. Une cellule qui débute S ne possède pas beaucoup plus d’ADN qu’en G1: elle sera encore classée en G1. De même, une cellule en fin de S à déjà 4C ADN et sera classée en G2. N 4 C G2, M S ADN X S caché: parfois plus de 25 % de S total.

29 LE PROBLEME DE LA PORTION CACHEE DE LA PHASE S
Les pic G1 et G2 sont statistiquement une courbe de Gauss qui reflète les erreurs expérimentales. Ces mêmes erreurs existent aussi dans tout l’histogramme et en tout point de la phase S Cette cellule S peut tout aussi bien être classée… N Ou là… en G1 …Ici , en S 4 C G2, M S ADN

30 Le modèle des rectangles de Bagwell
i s t r b u o n m a l e j é p c G 1 x . d ' A N , Nombre de cellules 2 à @ R g # P h S Le modèle des rectangles de Bagwell

31 2 C 4

32 Le programme ModFit (Verity software)
Tumeur fraîche (Vindelov) Tumeur parafine (Hedley) 50 100 150 200 250 Débris Diplo G1,G2M Diplo S Aneu G1,G2M Aneu S

33 Noyau G1 Noyau G2M Volt TEMPS DE VOL (µs) AIRE DE L'IMPULSION
. 1 2 Doublet G1 G2M G1 AIRE DE L'IMPULSION LARGEUR DE L'IMPULSION Volt TEMPS DE VOL (µs) Noyau G1 Noyau G2M TEMPS DE VOL

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37 MARQUEURS ASSOCIES A LA PROLIFERATION CELLULAIRE
Go G1 S G2 M ADN ARN BrdU 3-TdH p53 PCNA Ki-67

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39 . G0G1 S G2M ADN anti- BrdU-FITC Nombre de cellules (N) N ADN Total (PI) - + Anti-BrdU-FITC B C A DOUBLE MARQUAGE DE L'ADN TOTAL ET DE LA BrdU INCORPOREE (LIGNEE K 562)

40 La méthode de Begg

41 RM 1,0 0,9 0,8 0,7 Ts = 6h30' 0,6 0,5 0,4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

42 DEFINITION DES PARAMETRES FLS ET FLG1 : Méthode de Pallavicini
3 DEFINITION DES PARAMETRES FLS ET FLG1 : Méthode de Pallavicini Temps: 0,5 heure heures 2 4 1 3 + + - - 2 4 2C 4C 2C 4C FLG1 = (1) / (1) + (2) FLS = (3) / (3) + (4)

43 FLS 1 EVOLUTION THEORIQUE DES FRACTIONS FLS ET FLG1 9 T C CALCUL DES DUREES DES PHASES 8 7 6 FLG1 FLS 5 4 T S 3 1 2 H x 2 1 3 4 5 1 1 5 2 2 5 Temps (h) 5 6 7 8 FLG1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 9 T G 2 M T G 1 1 1 1 1 2 Temps (h) H y Temps (h) 2 5 1

44 Durée de S Durée du cycle Temps (Heures) CINETIQUE CELLULAIRE: DUREE DE LA PHASE S Thymus de souris saines, C57Bl/Ka FLS

45 CINETIQUE CELLULAIRE: DUREE DES PHASES G2+M ET G1
Thymus de souris normale C57Bl/Ka F L G 1 ( % ) Durée de : G2+M G1 H e u r e s

46 ACRIDINE ORANGE: une sonde métachromatique:
sa fluorescence change selon la nature monocaténaire ou bicaténaire des acides nucléiques .

47 ACRIDINE ORANGE

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50 CANCER DE LA VESSIE: DETERMINATION DE LA FRACTION Ki-67 POSITIVE
B Contenu en ADN Anti-Ki67-FITC CANCER DE LA VESSIE: DETERMINATION DE LA FRACTION Ki-67 POSITIVE . .

51 ADENOCARCINOME DU COLON, DUKES C
Population à ADN normal Population à ADN aneuploïde G1 G1 G2M G2M B 1,00 Ki67 + Ki67 - G0 1,39 ADN 2C 4C ADN total

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53 D u a l b e i n g f o w c y t m r h d : A p s ( N ) v F I T C - x 2 +

54 A p o p t o s e " p r é c o c e " A p o p t o s e " a v a n c é e " C T I F - 5 - e n i x e n n A I o d u r e d e p r o p i d i u m C e l l . n é c r o s é e s C e l l . v i v a n t e s

55 A p o p t o s e N é c r o s e V i v a n t e s