Introduction – Thérapie génique 09/09/2004 José CORTES.

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2 Introduction – Thérapie génique 09/09/2004 José CORTES

3 Mise au point d’une technique de cartographie à haut débit des sites d’intégration d’un vecteur rétroviral 09/09/2004 José CORTES

4 Introduction – Essai clinique d’Alain FISHER 09/09/2004 José CORTES 11 enfants atteints de X-SCID Cependant 2 enfants ont développé une Leucémie

5 Introduction – Etudes des sites d’intégrations (1) 09/09/2004 José CORTES L’équipe de Bushman Virus HIV-1 : Intégration préférentielle au niveau de gènes transcriptionnellement actifs L’équipe de Burgess Vecteurs HIV-1 : Intégration préférentielle à l’intérieur de l’unité transcriptionnelle. Vecteurs MLV : Intégration préférentielle aux alentours du +1 de la transcription.

6 Introduction – Etudes des sites d’intégrations (2) 09/09/2004 José CORTES Technique utilisée : Vecteur ou VirusADN génomique Digestion enzymatique (site de coupure fréquent) Ajout d’adaptateurs PCR Nested PCR Clonage et séquençage

7 Introduction – Objectif de mon stage 09/09/2004 José CORTES Réalisation de la technique

8 Résultats – 1ère partie (1) 09/09/2004 José CORTES Analyse des jonctions vecteur-ADN génomique NlaIII 5’ MmeI catg PVI Partie Vecteur Côté Reverse Séquence à analyser PLI3 Côté Universel Séquence cible de l’insertion Site d’insertion du vecteur schéma d’un contig réalisé par le logiciel BioEdit

9 Résultats – 1ère partie (2) 09/09/2004 José CORTES 211 clones bactériens séquencés

10 Résultats – 1ère partie (2) 09/09/2004 José CORTES 182 jonctions Sur 117 jonctions positionnables sans ambiguïté, 111 jonctions sont différentes.

11 Résultats – 1ère partie (3) 09/09/2004 José CORTES Positions des insertions détectées sur leurs chromosomes respectifs D’après le site http://genome.ucsc.eduhttp://genome.ucsc.edu Les traits rouges représentent la position des intégrations détectées Les chromosomes encadrés en rouge n’ont subit aucune modification par le vecteur

12 Résultats – 1ère partie (4) 09/09/2004 José CORTES

13 Résultats – 2ème partie (1) 09/09/2004 José CORTES 102 pb 12 100 pb 44 pb 30 pb bPLI bPLN PCR bPLN/bPLN NlaIII Digestion NlaIII Ligation LN2 NlaIII 5’ NlaIII 5’ MmeI Digestion par MmeI NlaIII MmeI 58 pb 12 100 pb 20 pb

14 Résultats – 2ème partie (1) 09/09/2004 José CORTES bPLI bPLN PCR bPLN/bPLN NlaIII Digestion NlaIII Ligation LN2 NlaIII 5’ NlaIII 5’ MmeI Digestion par MmeI NlaIII MmeI 100 pb 20 pb 1234 1 : PCR bPLN/bPLI 2 : Fragment digéré par NlaIII4 : Fragment de 26 pb purifié 3 : Purification sur billes Puits n°4

15 Résultats – 2ème partie (1) 09/09/2004 José CORTES bPLI bPLN PCR bPLN/bPLN NlaIII Digestion NlaIII Ligation LN2 NlaIII 5’ NlaIII 5’ MmeI Digestion par MmeI NlaIII MmeI 500 pb 1000 pb région 600-1200 pb

16 Résultats – 2ème partie (2) 09/09/2004 José CORTES Analyse des concatémères NlaIII

17 Résultats – 2ème partie (3) 09/09/2004 José CORTES Étiquettes obtenues : Sur 40 séquences de concatémères, 1002 étiquettes on été extraites. Moyenne de 25 étiquettes par concatémère

18 Résultats – 2ème partie (4) 09/09/2004 José CORTES Comparaison des étiquettes sur le génome

19 Résultats – 2ème partie (5) 09/09/2004 José CORTES Comparaison des étiquettes sur le génome

20 Résultats – 2ème partie (5) 09/09/2004 José CORTES

21 Conclusion 09/09/2004 José CORTES Objectif atteint 211 séquences -> 111 jonctions différentes sur le génome 40 séquences de concatémères -> 207 étiquettes différentes, positionnables sans ambiguïté sur le génome

22 Remerciements 09/09/2004 José CORTES Olivier DANOS Équipe Ciblage Javier PEREA Nathalie HOLIC-BARLET Julie MANTOVANI Service Séquençage Sabine Dubus Service Informatique Kelly MARTINEZ Aux Généthoniens…