La transgénèse chez les espèces animales

Présentation au sujet: "La transgénèse chez les espèces animales"— Transcription de la présentation:

1 La transgénèse chez les espèces animales
Définitions Les buts Les transgènes La génération de souris transgéniques La transgénèse chez les autres espèces Les systèmes d’expression conditionnelle

2 Qu’est ce qu’un animal transgénique ?
Un animal transgénique est un animal ayant intégré de manière artificielle un fragment d’ADN étranger dans son génome.

3 Pourquoi créer des animaux transgéniques ?
Modèles pour la recherche expérimentale Modèles de maladies humaines Humanisation de modèles animaux Toxicologie Production de protéines recombinantes Amélioration des espèces d’intérêt agronomique

4 Stratégie générale pour la création d’animaux transgéniques
transgène 1-4 mois microinjection/implantation 2-4 mois intégration du transgène (F0) établissement de lignées -/+(F2) 4-6 mois expression du transgène 1 mois utilisation

5 Principe général pour la construction d’un transgène
plasmide  Promoteur ADNc polyA  constitutif tissu-spécifique conditionnel protéine ARN antisens ribozyme

6 Expression constitutive
But : obtenir l’expression du transgène dans la plupart des tissus, voire toutes les cellules de l’organisme. Moyen : promoteur ubiquitaire. Promoteurs utilisables : - Viraux : RSV CMV - Mammifères : b-actine Métallothionéine

7 Problèmes liés à l’utilisation des promoteurs constitutifs
Niveau d’expression peut être très élevé. Le caractère ubiquitaire de l’expression n’est pas garanti à 100 %, même avec des promoteur viraux.

8 L’expression ciblée But : obtenir l’expression du transgène dans un tissu ou un type cellulaire bien précis. Moyen : promoteur dont l’activité est spécifique d’un organe, d’un tissu ou d’un type cellulaire. Promoteurs utilisables : - Foie : albumine 2,3 kb - Tissu adipeux aP2 5,4 kb - Muscle myosine - Cellules pancréatique b insuline 345 bp - Cellules gliales GFAP

9 Considérations à prendre en compte lors de l’utilisation de promoteurs tissu-spécifiques
La spécificité n’est pas nécessairement identique in vitro et in vivo. La spécificité du promoteur implique une régulation importante. Possibilité autorégulation du transgène (- ou +) Variations d’expression plus ou moins maîtrisables

10 Données essentielles sur le génome de Mus musculus
Nb de chromosomes 40 ADN diploïde bp (6pg/cell) Nb de gènes Séquençage % séquences répétées 10%

11 Données essentielles sur la reproduction de Mus musculus en laboratoire
Gestation jours sevrage 3 semaines Maturité sexuelle 6 semaines Poids naissance (1 g) sevrage (8-12 g) adulte (30-40 g) Durée de vie mois Taille moyenne des portées 3-11 Nb de portée par femelle 4-8

12 Les souches de souris “inbred”
Définition C’est une souche qui a été maintenue pendant plus de 20 générations par croisements successifs entre frères et sœurs et homozygote pour tous les locus. Souches inbred les plus utilisées pour la transgénèse C57BL/6J CBA/J C3H/HeJ DBA/2J

13 La transgénèse chez la souris
Avantages Relativement rapide Travail de BM restreint Inconvénients Intégration au hasard Nécessité de plusieurs lignées

14 Les différents types de souris trangéniques
Analyse de séquences régulatrices in vivo. Surexpression d’une protéine d’intérêt dans un tissus. Inhibition (ARN antisens, ribozymes, siRNA).

15 La microinjection

16 L’identification des souris transgéniques
ADN génomique (queue) Analyse par PCR Analyse par Southern blotting (Nbre de copies, homozygotes)

17 Génotypage par PCR et Southern blotting
5.4 kb aP2 promoter intron rat agt cDNA 300 bp Southern blot Bgl II sites agt transgene 5 kb Exons néo agt targeted allele 3 kb Exons agt endogenous allele 2 kb

18 Bilan d’une expérience de transgénèse chez la souris (1)
Etape Nbr % Embryons injectés Survie Embryons implantés 78 41 Souriceaux nés 15 7,9 Souris trasgéniques 3 1,6

19 L’établissement des lignées
F0 F1 F2

20 Bilan d’une expérience de transgénèse chez la souris (2)
Lignée Nbre de copies Transmission mendelienne oui oui oui oui Expression oui non oui non

21 L’expression du transgène (1)
ARN (Northern, RPA, HIS) Protéine (western, immunohistochimie) Les techniques utilisées dépendent des outils disponibles et du matériel biologique.

22 L’expression du transgène (2)

23 L’analyse du phénotype

24 Stratégie pour la réexpression dans un fond KO (rescue, humanisation)
agt +/+ X agt -/- F0 aP2 agt +/- aP2 agt -/- 50 % 50 % F1 X agt +/- agt +/- agt -/- aP2 agt -/- aP2 agt +/- aP2 agt -/- 25 % F2 agt -/- aP2 agt +/-

25 Génotypage par PCR et Southern blotting
5.4 kb aP2 promoter intron rat agt cDNA 300 bp Southern blot Bgl II sites agt transgene 5 kb Exons néo agt targeted allele 3 kb Exons agt endogenous allele 2 kb

26 La transgénèse chez les autres vertébrés
Bovins (agronomie,GH) Caprins (industrie pharmaceutique, facteur X) Porc (médecine, xénogreffes) Poissons (agronomie, GH, AFP) Amphibiens (recherche)