Purification et caractérisation des protéines

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1 Purification et caractérisation des protéines
CHMI 2227F Biochimie I Purification et caractérisation des protéines CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

2 Purification des protéines
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

3 Purification des protéines Procédure générale
Homogénéisation Extrait protéique brut Étapes de purification grossières Chromatographie 1, 2, 3….x étapes PURE! (bon, bin, j’espère…) Détection de la présence de la protéine d’intérêt: Activité Pureté Quantité CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

4 Purification des protéines 1. Méthodes grossières
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

5 Précipitation différentielle 1.1. Précipitation par modification du pH
solubilité pI CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

6 Précipitation différentielle 1.2 «Salting out »
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

7 Précipitation différentielle 1.2.Salting out
Mélange de protéines dans un tampon: A: précipite à [ ] sel = 15% B: précipite à [ ] sel = 25 % C: précipite à [ ] sel = 35% Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à 20% Centrifuge pour récupérer les protéines précipitées Culot: protéine A Surnageant: protéines B + C Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à 30% Culot: protéine B Surnageant: protéine C CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

8 Centrifugation CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

9 Dialyse Heures CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

10 Purification des protéines 2. Méthodes fines
Colonne Collecteur de fractions Réservoir de tampon Pompes Injecteur (échantillon) CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

11 Purification des protéines 2.1. Chromatographie à échange d’ions
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

12 Purification des protéines 2.1. Chromatographie à échange d’ions
Desorption Adsorption Anion exchanger NaCl Exemple de chromato. à échange de cations CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

13 Purification des protéines 2.1. Chromatographie à échange d’ions
Changement linéaire de concentration de NaCl Changement brusque de concentration de NaCl Ajoute tampon CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

14 Purification des protéines 2.2. Tamisage moléculaire
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

15 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

16 Purification des protéines 2.2. Tamisage moléculaire
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

17 Purification des protéines 2.3. Chromatographie d’affinité
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

18 Analyse des protéines Électrophorèse
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

19 Électrophorèse 1. Électrophorèse PAGE-SDS
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

20 Électrophorèse 1. Électrophorèse PAGE-SDS
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

21 Électrophorèse 1. Électrophorèse PAGE-SDS
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

22 Électrophorèse 1. Électrophorèse PAGE-SDS
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

23 Électrophorèse 1. Électrophorèse PAGE-SDS
Log Mr Distance migrée à partir du puits (cm) CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

24 Électrophorèse 2. Focalisation isoélectrique
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

25 Électrophorèse 2. Focalisation isoélectrique
pH in gel = pI of proteins CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

26 Électrophorèse 3. Électrophorèse à deux dimensions
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

27 Électrophorèse 3. Électrophorèse à deux dimensions
Chaque tache est une protéine CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

28 Électrophorèse 4. Analyse Western
Structure d’un anticorps CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

29 Électrophorèse 4. Analyse Western
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

30 Purification des protéines Exemple et analyse des données
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

31 Purification des protéines Exemple et analyse des données
Gel de PAGE-SDS coloré au Bleu de Coomassie CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

32 Purification des protéines Exemple et analyse des données
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

33 Séquençage des protéines
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

34 Séquence des protéines - anémie falciforme
Globule rouge normal Globule rouge falciforme CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

35 Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes
Basé sur la propriété de réactifs chimiques/enzymes de couper le lien peptidique à un endroit très précis; Enzyme Acide aminé Site de coupure Trypsine Arg/Lys C-ter Chymotrypsine Phe/Trp/Tyr Protéase V8 Asp/Glu Pepsine N-ter Thermolysine Leu/Ile/Trp/Tyr/ Val/Ala/Phe Carboxypeptidase A Tous les a.a. en C-ter., sauf Pro, Arg/Lys - Libère l’acide aminé C-ter - Ne coupe pas si Pro est l’avant dernier acide aminé. Carboxypeptidase B Seulement Arg/Lys quant C-ter. Réactif Acide aminé Site de coupure Bromure de cyanogène Met C-ter b-mercaptoéthanol Cys Ponts disulfure Iodoacétate Prévient la réduction des ponts disulfure 1) 1-Fluoro-2,4 dinitrobenzène (FDNB) 2) Chlorure de dansyl 3) Chlorure de dabsyl Détruit tous les acides aminés sauf ceux en N-ter. Hydrazine Détruit tous les acides aminés sauf ceux en C-ter. NOTE: Trypsine, Chymotrypsine, protéase V8, pepsine et thermolysine ne COUPENT PAS si Pro fait partie du lien peptidique. CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

36 Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes – exemple 1
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

37 Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes – exemple 2
Les données suivantes ont été obtenus après traitement d’un octopeptide: HCl 6M: Ala, Gly2, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr CNBr: 2 peptides sont obtenus: Peptide 1: Ala, Gly, Lys, Thr Peptide 2: Gly, Met, Ser, Tyr Trypsine: 2 peptides sont obtenus: Peptide 3: Ala, Gly Peptide 4: Gly, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr Chymotrypsine: 2 peptides sont obtenus: Peptide 5: Gly, Tyr Peptide 6: Ala, Gly, Lys, Met, Ser, Thr FDNB: donne Gly Carboxypeptidase A: donne Gly Quelle est la séquence de ce peptide? CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

38 Détermination de la séquence 2. Dégradation d’Edman
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

39 Détermination de la séquence 2. Dégradation d’Edman
Identification CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

40 Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de masse
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

41 Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de masse
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.

42 Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de masse
CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.