Boiningénierie de l’ADN CHMI 3216 E

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1 Boiningénierie de l’ADN CHMI 3216 E
Semaine du 14 Septembre 2007 Boîte à outils, 2ième partie. Plasmides, clonage d’ADN 101 E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

2 Plasmides Plasmides: Molécules d’ADN circulaires extrachromosomales
Caractéristiques de base: Origine de réplication: permet au plasmide de se répliquer de manière autonome; Gène de résistance à un antibiotique: permet la sélection de bactéries possédant le plasmide; Site de clonage multiple (multiple cloning site -MCS): une petite région du plasmide crée en laboratoire et contenant un certain nombre de sites de coupure uniques pour des enzymes de restrictions. E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

3 Plasmides – origine de réplication
Origine de réplication (Ori): courte séquence d’ADN permettant à l’ADN polymérase bactérienne de lier et initier la réplication du plasmide; Il existe plusieurs types d’Ori. ColE1 celui rencontré le plus souvent; Certaines Ori permettent au plasmide de se répliquer fréquemment (plasmides à nombre de copies élevées – jusqu’à 100 copies par bactérie); d’autres Ori ne permettent qu’un taux relativement faible d’initiation de la réplication (plasmides à nombre de copies faible– seulement quelques copies de plasmide par bactérie); E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

4 Plasmides – gènes de sélection
Gènes codant des protéines permettant la résistance bactérienne à un antibiotique particulier; Gènes le plus souvent rencontrés: Ampr: résistance à l’ampicilline Kanr: résistance à la kanamycine Tetr: résistance à la tétracycline Les bactéries possédant un plasmide ayant le gène Ampr seront capable de survivre lorsque cultivées dans un milieu de culture contenant de l’ampicilline; E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

5 Plasmides – sites de clonage multiples
MCS: une région limitée du plasmide crée artificiellement et qui possède plusieurs sites de coupure uniques pour un ensemble d’enzymes de restriction; Les sites de restriction retrouvés dans le MCS ne sont pas retrouvés ailleurs dans le plasmide en question. E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

6 Plasmides – autres caractéristiques
Promoteurs pour les ARN polymérases virales Sp6, T7 or T3 Permet de faire des expériences de transcription in-vitro; Origine de réplication du phage F1: Permet la préparation de plasmides simple-brin; Gènes codant pour des ARNt suppresseurs Gènes indicateurs (reporter genes): Permettent l’identification rapide et simple de colonies bactériennes possédant des propriétés particulières; P.ex..: Lac z (code la b-galactosidase); E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

7 Plasmides – Gène de sélection SupF
ARNt suppresseur Insère l’ acide aminé Glu au codon stop UAA; Permet la survie de bactéries possédant un épisome (plasmide naturel) P3: l’épisome P3 possède les gènes de résistance Ampr et Tetr interrompus parle codon stop UAA. E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

8 E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

9 Plasmides – pBR322 E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

10 Plasmides - pBluescript
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11 Plasmides – vecteurs navette
Les vecteurs navette peuvent être utilisés dans au moins deux organismes vivants différents: Bactéries (obligatoire) Levures Insectes Plantes Mammifères E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

12 Plasmides – Vecteurs navette
Vecteur navette pour bactérie/levures; Leu2: Gène de sélection pur la croissance chez la levure; Code pour un gène permettant la synthèse de l’acide aminé Leu dans des cellules de levures incapables de produire la Leu par elles-mêmes (auxotrophe); Les levures possédant ce vecteur pourront croître dans un milieu de culture ne contenant pas la Leu. E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

13 Clonage d’ADN Pourquoi cloner l’ADN? Obtenir de grandes quantités
Caractériser les propriétés spécifiques à un ADN particulier: Séquence Mutagenèse Pour exprimer une protéine spécifique in vitro ou dans une organisme vivant: P. ex: production d’insuline recombinante: mieux que l’insuline purifiée du sang, qui peut être contaminée par des virus (hépatite, HIV) ou autres belles petites choses (prions); E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

14 Clonage d’ADN – Étapes de base
1. Coupe l’ADN d’intérêt et le plasmide avec un enzyme de restriction approprié; 2. Mélange les deux ensemble et soude les bouts libres avec l’ADN ligase (ligation) 3. Insère l’ADN/plasmide (plasmide recombinant) dans des bactéries (transformation) Requiert l’utilisation de bactéries compétentes. 4. Sélection des bactéries résistante à un antibiotique et recherche des bactéries possédant le fragment inséré dans le plasmide. 5. Confirmation du clonage Digestion par enzyme(s) de restriction Séquençage E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

15 Clonage d’ADN – Étapes de base
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16 Clonage d’ADN Traitement du vecteur à la phosphatase alcaline:
Permet de réduire le bruit de fond (background) de bactéries possédant le plasmide n’ayant pas incorporé le fragment d’intérêt. Des bouts francs peuvent être utilisés pour le clonage (un rapport fragment d’DNA/plasmide devra être plus élevé: 10/1 au lieu de 3/1) Les bouts de l’ADN d’intérêt peuvent être modifiés par la Klenow afin d’accommoder les sites de restriction disponibles sur le vecteur (et vice-versa). L’utilisation d’adaptateurs et linkers peut faciliter grandement le clonage. E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

17 Adaptateurs et linkers
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18 Devoir #2 E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009