Séquençage des protéines

Présentation au sujet: "Séquençage des protéines"— Transcription de la présentation:

1 Séquençage des protéines

2 plan Introduction Définition intérêt
Détermination de la séquence en acides aminés Préparation de la protéine pour le séquençage: Séquençage des chaines polypeptidiques: Reconstitution de la séquence complète

3 La chaine polypeptidique
Introduction: Rôles des protéines structure La chaine polypeptidique Acides aminés séquençage

4 Définition: La stratégie de base Frederick Sanger 1953
La nature Le nombre L’ordre La stratégie de base Frederick Sanger 1953 La première séquence: l’insuline

5 Intérêt du séquençage:
Comprendre le mécanisme d’action au niveau moléculaire Comparaison des séquences de protéines analogues}fonctionnement Clinique, diagnostique des mutations

6 Détermination de la séquence en acides aminés :
Préparation de la protéine pour le séquençage Séquençage des chaines polypeptidi- ques Reconstitution de la structure complète

7 Préparation de la protéine pour le séquençage:
Déterminer le nombre de chaines polypeptidiques: analyse des groupements terminaux insuline Résidus N terminaux Phe et Gly 2 types de ch polypep en nombre =

8 Identification des résidus Nterminaux:
Méthode de Sanger(FDNB)

9 Méthode des dansylaminoacides:

10 Méthode d’Edman:

11 Méthodes enzymatiques: exopeptidase ; aminopeptidase :
hydrolysent séquentiellement les acides aminés depuis l’extrémité N-terminale d’un polypeptide

12 Identification des résidus C terminaux:
Hydrazinolyse: un polypeptide est traité par l’hydrazine anhydre à90°C pendant 20 à 100 heures toutes les liaisons peptidiques sont rompues et tous les résidus sont transformés en hydrazides sauf le résidus C-terminale que l’on retrouve sous forme d’acide aminé libre facile à isoler et à identifier par chromatographie

13 Méthode enzymatiques : carboxypeptidase

14 Coupures des ponts disulfures:
Réduction par le 2-mercaptoethanol:

15 Séparation purification des chaines polypeptidiques
Milieu acide ou basique, C saline élevée, T° élevée Urée Ion Guanidinium SDS chromatographie

16 Détermination de la composition en acides aminés:
Hydrolyse des liaisons peptidiques Analyse qualitative et quantitative; chromatographie

17 Hydrolyse enzymatique
détermination de: Trp Gln Asn un mélange de peptidase; pronase[1] (streptomyces griséus)

18 séquençage des chaines polypeptidiques:
Réaction d’hydrolyse spécifique: Séparation purification des fragments: Détermination de la séquence en AA des fragments:

19 Réaction d’hydrolyse spécifique:
Bromure de cyanogène: après Met N-Bromosuccinimide HOBr:après Tyr Try HydroxylamineNH2OH: hydrolyse les liaisons Asn-Gly

20 Séparation purification des fragments:
Dénaturant : Urée , SDS Support de CHromato HPLC Phase inverse

21 Détermination de la séquence en AA des fragments:
les petits fragments cycles répétés (Edman) dispositif automatiq

22 Reconstitution de la séquence complète:
Mise en ordre des fragments

23 LABORATOIRE DE BIOCHIMIE CHU CNE
Dr. BENDJAZIA MA. ALLOUI. AS FEV 2012