Real-Time PCR assay for rapid and accurate detection of point mutations conferring resistance to clarithromycin in Helicobacter pylori.

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1 Real-Time PCR assay for rapid and accurate detection of point mutations conferring resistance to clarithromycin in Helicobacter pylori

2 Introduction Helicobacter pylori
Bactérie Gram (-) qui affecte la muqueuse gastrique Responsable d’ulcères et de cancers gastriques Microaérophile Règne : Bacteria Division : Proteobacteria Famille : Helicobacteraceae Genre : Helicobacter

3 Thérapie d’éradication:
Utilisation de clarithromycine : Antibiotique macrolide Empêche la croissance bactérienne en interférant avec la synthèse des protéines bactériennes. Fixation à la s.u. 50S des ribosomes bactériens au niveau du site P et empêche le transfert du complexe peptidyl-ARNt du site P vers le A Problème : l’augmentation de la résistance, due à des mutations ponctuelles sur la région codant la peptidyl-transférase de l’ARNr 23S. A2142C; A2142G; A2143G

4 Pour l’étude : Souches bactériennes et biopsies gastriques
Contrôles positifs: 1 souche H.pylori wt 3 souches avec chacune une mutation différente Contrôles négatifs : 17 biopsies de patients négatifs à H.pylori. 200 biopsies de patients ont été réalisées.

5 Matériel et méthodes Détection de la résistance à la clarithromycine
Méthodes phénotypiques : E-Test : gradient de concentrations d’Ab dans une bandelette Par dilution dans un milieu gélosé Souche résistante quand CMI>1mg/L Problème : méthodes longues CMI : Plus faible concentration d’Ab pour laquelle il n’y a pas de croissance visible de la souche

6 Objectif de l’article : Développer une méthode simple et rapide pour détecter les 3 mutations les plus fréquentes associées à la résistance à la clarithromycine chez Helicobacter pylori, directement sur des biopsies gastriques.

7 Méthodes moléculaires
Restriction fragment lenght polymorphism (RFLP) Nouvelle méthode : PCR en temps réel, basée sur l’amplification d’un fragment du gène ribosomal 23S de H.pylori (ici un fragment de 267pb).(primers spécifiques de H.pylori). A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou d’amplicon est mesurée grâce à un marqueur fluorescent. En fin de manip : courbe de fusion de quantification . Courbe en cloche dont l'abscisse du maximum est le Tm du produit de la PCR (45°C à 75°C par palier de 0.1°C) L'acquisition de l'intensité de fluorescence en continu.

8 Détection des mutations ponctuelles conférant la résistance à la clarithromycine chez les contrôles
Tm< Tm(wt) mismatch séquence-sonde d’hybridation Diférenciation difficile Contrôles positifs Détection d’1 wt et de 2 mutants ds la même biopsie + résultats négatifs chez des patients H.pylori(-).

9 Détection des mutations ponctuelles conférant la résistance à la clarithromycine dans les biopsies gastriques par PCR en temps réel. Détermination du génotype associé à la sensibilité ou à la résistance pour 200 biopsies par PCR temps réel Wt ms résistant! Différence entre E-test et méthode de dilution 152/157: corélation PCR et E-Test

10 Génotype responsable de la sensibilité ou de la résistance à l’Ab a été identifié avec succès.
Dans la plupart des biopsies : 1 seul génotype Quelques cas avec 2 génotypes 1 cas avec 3 génotypes. Concordance des méthodes phénotypiques à 98% et PCR à 96.4%.

11 Comparaison PCR en temps réel et PCR-RFLP
Confirmer les résultats de la PCR tps réel 30 échant seul génotype 42 biopsies (Plusieurs génotypes) Pas de coupures Résultats de PCR tps réel concordants avec ceux de PCR-RFLP.

12 11 résultats en désaccord.
Mélange de génotypes wt et de génotypes coupés par enz Cas inverse Autres mutations? Discordance entre les 2 tests phénotypiques

13 Conclusion Méthode rapide permettant de détecter les mutations les plus courantes sur le gène 23S chez H.pylori conférant la résistance à la clarithromycine. Distinction entre les génotypes : basée sur le Tm des courbes de fusion. Détection de populations mixtes (détection d’1 mutant parmi des wt à partir de 10%). Résultats discordants entre les méthodes dus à une concentration trop basse de mutants. Méthode génotypique plus sensible. Hypothèse non exclue : les 2 génotypes peuvent correspondre au 2 allèles du gène 23S. (- probable)