The ATD project is funded by the European Commission within its FP6 Programme, under the thematic area "Life sciences, genomics and biotechnology for health",

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1 The ATD project is funded by the European Commission within its FP6 Programme, under the thematic area "Life sciences, genomics and biotechnology for health", contract number LHSG-CT-2003-503329 William Ritchie, TAGC INSERM, Marseille

2 Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets Courts ARNnc (20-25 nt) qui servent de régulateurs post-transcriptionnels Issus de mRNAs de plus grande taille (60-90) : qui forment des tiges boucles: pre-miRNA

3 Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets Plant miRNA: clivage des mRNA Animal miRNAs: repression de la traduction Lim et al. (2005): dans le model animal les miRNAs peuvent abaisser le niveau des messagers Mir-124Mir-1

4 Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets Se fixent sur la région non traduite du 3’ (UTR) Comment sont affectés les niveaux d’expression si une forme est ciblée et une autre ne l’est pas ? Trouver des gènes qui possèdent au moins deux isoformes dont une (la plus longue) a une cible de miRNA (dans l’UTR 3’) et l’autre n’en a pas. CDS

5 Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets la reconaissance de la cible par le miRNA implique souvent une courte séquence 6-8 nt hautement conservée apellé « seed » Human Mouse Rat Dog Chicken En utilisant les données d’Ensembl un assemblage de 3495 UTRs conservés (human, mouse, dog, rat) est crée Recherche de toutes les sequences de 7nt sequences parfaitement conservés: cibles potentielles de miRNA

6 Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets En utilisant des comptages d’EST on compare le niveau d’expression des isoformes ciblées et des isoformes non ciblées Non-targeted isoforms targeted isoforms % of total ESTs « Non-targeted » isoforms « targeted » isoforms Control P=0.38 P=7e-5 Les isoformes ciblées ont un niveau d’expression plus élevé !!!

7 Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets a Non CardiovascularBrain Non Brain Cardiovascular MiR-124a MiR-1 nttttt Relative isoform expression (%) Mais n’y a-t-il pas un effet tissu spécifique ? evoc ontology (v26)

8 lym - pho - reti -brainres - pira - tory uro - geni - tal muscu - los -Ali - men - tary car - dio - vas -En - do - crine dermal 051015202530 1/p.value 19 25 35 42 29 26 10 <10 MiR-124a lym-pho-reti - brainres-pira-toryuro-geni-talmuscu-los - ali-men-tarycar-dio-vas - en-do-crinedermal0510152025 1/p.value 31 15 61 84 39 43 16 <10 11 MiR-1 Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

9 Disrep 10 genes 3 types tissulaires differents Cible potentiel de miRNA Tous tissus Tissu 1Tissu 2Tissu 3 P>0.05 P<0.05

10 Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets 14640 distinct motifs (373,948 sites) Motif present downtream of 1 st polyA site + Differential Isoform Repression test (p<0.05) 9334 motifsDISREP: 312 motifs 7-mers in 10 mRNAs and 3 tissues Four-way Conserved 7-mers in 3’ UTRs 6.4 e -3 1.2 e -4 1.0 e -8 p-value enrichment 2829312After Disrep 4462609334 7-mers conserved in 4 species (>10 genes, > 3 tissues) PUF protein fixation site ARE MiRNA targets Total motifs

11 Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets Proportion of targets for Known miRNAs in motifs (%) p-value for differential repression of targeted isoforms 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16% < 0.01< 0.05< 0.1< 0.5 Disrep Shuffle 45 3 12 760 3810 2 9.6 2 61.2 710.1 3832.1

12 Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets Trouver les 7-mers complementaires dans le genome Extraire +/- 80 ntEnergie de repliement < -45Kcal Four-way multi alignment + RNAZ p-value > 0.99 + Criteres de structure et séquence 213 miRNA precursors (211 miRNAs) Motif present downtream of 1 st polyA site + Differential Isoform Repression test (p<0.05) 9334 motifs DISREP: 312 motifs Hits de Megablast dans souris+rat+chien, avec la seed 100% conservée Clustering des precurseurs chevauchants et elimination de ceux qui touchent au codant 456 miRNA precursors 7-mers dans 10 mRNAs et3 tissus 45 in miRNA registry 38 predicted by recent studies 128 novel precursors

13 Et les cibles qui ne correspondent pas a des precurseurs de miRNA Certaines cibles ne correspondent pas a des precurseurs potentiels Peut etre des sites de fixation d’un autre type d’ARNnc Longueur inconnue, structure inconnue Rechercher des motifs conservés et strusturéc

14 Et les cibles qui ne correspondent pas a des precurseurs de miRNA ● Alignements tout génome l'UCSC en utilisant des chaines de Markov et un filtre synthenie (homme,souris,chien,rat + zebrafish ou fugu) ● 5' UTR, 3' UTR, Intron, Intergenique ● Recherche de regions conservées ● Conservation d'une structure (RNAz p>0,9) ● Clustering hierarchique des differentes structures

15 ● RNAforester

16 ● Trop de branches tue la branche !!

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