Diagnostic des viroses

Présentation au sujet: "Diagnostic des viroses"— Transcription de la présentation:

1 Diagnostic des viroses
décembre 2007 Virologie

2 Introduction Le diagnostic est avant tout clinique
Pourquoi (ou pour qui) aller plus loin ? :  affirmer le rôle effectif d’un virus pour des patients immunodéprimés de façon à pouvoir traiter ou prévoir l’évolution de la maladie, détecter la présence effective du virus pour éviter la virose (prophylaxie pour : greffons, transfusions, rubéole pour les femmes enceintes, sida pour les sexuellement actifs…) surveiller une épidémie et préparer les futurs vaccins décembre 2007 Virologie

3 Mise en évidence du virus
décembre 2007 Virologie

4 1. Mettre en évidence le virus
Par microscopie électronique décembre 2007 Virologie

5 1. Mettre en évidence le virus
 Par immunolatex, immunofluorescence ou immunoenzymologie décembre 2007 Virologie

6 1. Mettre en évidence le virus
Par des techniques de biologie moléculaire décembre 2007 Virologie

7 Recherche RT-PCR Identification
Détection des Norwalk-like par RT-PCR Fabienne Loisy , Pierre Le Cann , Monique Pommepuy Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer - Direction de l'Environnement et de l'Aménagement Littoral Département Microbiologie et Phycotoxines, BP 21105, Nantes Cedex 3, France RNA extraits incluant le RNA viral recherché Captation des RNA viraux spécifiques par une sonde biotynilée, fixée sur une bille magnétique streptavidinylée Purification par lavage du RNA viral : l’aimant permet de récupérer spécifiquement la sonde. Transcription inverse du RNA viral puis Amplification par RT-PCR avec les amorces, les enzymes RT MuL V et DNA polymérase. L’amorce est la sonde Détection des amplicons classique. RT-PCR : Amplification d’un RNA en DNA par transcription inverse en cDNA suivi d’une amplification classique. décembre 2007 Virologie

8 PCR en temps réel Fonctionnement de la PCR en temps réel :
La plupart des PCR temps réel sont basées sur la mesure d’émission de fluorescence proportionnelle à la quantité de gènes amplifiés. Plusieurs techniques existent : elles utilisent soit des molécules se liant à l'ADN, soit des sondes moléculaires spécifiques de la cible amplifiée. Un seul exemple est développé. (voir notamment le site Pour compléments) décembre 2007 Virologie

9 PCR en temps réel Un exemple d’utilisation de sondes :
La fluorescence est obtenue par l’utilisation d’une sonde marquée. Le but est de faire apparaître la fluorescence de manière proportionnelle à la quantité d'ADN cible présent. Deux marqueurs sont nécessaires : un marqueur R (reporter) émetteur de fluorescence et un marqueur Q (quencher) qui absorbe cette fluorescence lorsque R et Q sont proches. Lorsque Q et R sont séparés soit par hydrolyse de la sonde, soit lors de l’hybridation des amorces, soit lors de la synthèse du brin complémentaire, la fluorescence de R n’est plus absorbée. La mesure de la fluorescence est donc proportionnelle au nombre d'ADN produits par la PCR, lui même proportionnel au nombre d'ADN cibles présents au départ. L'utilisation de sondes spécifiques de l'ADN cible recherché permet d'obtenir une très grande sensibilité décembre 2007 Virologie

10 PCR en temps réel :Exemple
Les courbes obtenues ont cette allure : Intensité de fluorescence Cycles de PCR Exemple d’application médicale : dosage de HCV dans le sérum. décembre 2007 Virologie

11 1. Mettre en évidence le virus
Par culture problèmes de SÉCURITÉ  Technique : prélèvement : écouvillons en gélose Charbon, aspirations ou sécrétions dans du milieu de Hanks, selles Conserver à 4°C culture sur MRC5 ou Véro après décontamination microbienne. Addition possible d’anticorps connus pour étudier l’inhibition de la culture en parallèle à la culture. examen des cultures pour déterminer les effets cytopathologiques (cytopathiques). décembre 2007 Virologie

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14 2. Mise en évidence ou titrage d’anticorps
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15 introduction Intérêt : rapide économique dangers virologiques faibles
Inconvénients :  fenêtre de séronégativité nécessite parfois deux prélèvements successifs et un titrage décembre 2007 Virologie

16 techniques Techniques classiques : immunoenzymologie
immunofluorescence fixation du complément, inhibition de l’hémagglutination… Techniques particulières :  neutralisation de l’ECP du virus par le sérum du malade western blot décembre 2007 Virologie