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Initiation à la spectrométrie de masse électrospray (ESI-MS)

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Présentation au sujet: "Initiation à la spectrométrie de masse électrospray (ESI-MS)"— Transcription de la présentation:

1 Initiation à la spectrométrie de masse électrospray (ESI-MS)
Sir JJ Thompson 1912 TP CPMI 17 et 18 Février 2011 Nierengarten Hélène

2 Prix Nobel de chimie 2002 From the official Nobel press release :
« Mass spectrometry is a very important analytical method used in practically all chemistry laboratories the world over. Previously only fairly small molecules could be identified, but John B. FENN and Koichi TANAKA have developed methods that make it possible to analyse biological macromolecules as well ». J.B. Fenn K. Tanaka

3 Quelques exemples d’utilisation de la spectrométrie de masse:
- Dosage des médicaments en pharmacocinétique (LC-MS et /ou LC-MS/MS) - Analyse protéomique (nanoLC-MS/MS sur les peptides extraits des gels après digestion de la protéine et MALDI-MS) - Vérification des protéines recombinantes glycosylées hétérogènes (MALDI-MS sur protéine intacte et/ou sur digeste enzymatique) - Police scientifique (GCMS) Archéologie (isotopic-MS) Armée, NASA,…….etc.

4 Qu’est-ce que la spectrométrie de masse ?
C’est une méthode de mesure des rapports masse-sur-charge (m/z) de molécules individuelles et ionisées 1500 2000 600 1000 m/z 100 1283.2 Intensité Thomson

5 Que détermine-t-on exactement par spectrométrie
de masse ? 1)Masse monoisotopique c’est la masse du premier pic du profil isotopique càd celle qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables (C12, H1, O16, S32, N14, …). Distribution Isotopique 1500 2000 600 1000 m/z 100 1283.2 Intensité

6 Masse monoisotopique c’est la masse du premier pic du profil isotopique càd celle qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables (C12, H1, O16, S32, N14, …). Pic monoisotopique m/z P P+1 P+2 P+3 P+4 Masse monoisotopique: dans le massif isotopique, on l’appelle le pic P Les autres pics du massif isotopique sont appelés les pics P+1, P+2, P+3,…. Il contiennent tous au moins 1 des isotopes lourds d’un éléments.

7 Les isotopes • La plupart des éléments apparaissent dans la nature comme des mélanges d’isotopes • Un élément est défini par: AEZ – Son numéro atomique Z – Son numéro de masse A • Isotopes: atomes de même numéro atomique et de nombre de masse différents Element Ab (%) Isotope 1H1 100 2H1 0,015 12C6 13C6 1,12 14C6 0,057 14N7 15N7 0,36 16O8 17O8 0,04 18O8 0,2

8 Que détermine-t-on exactement par spectrométrie de masse ?
2) Masse chimique ou moyenne c’est le barycentre des masses des pics constituant le profil isotopique càd la masse qui prend en compte la masse des éléments donnée par le tableau périodique. Masse moyenne = barycentre

9 La masse que l’on mesure va donc dépendre de la résolution de l’instrument
Vallée à 10 % M M + DM DM R = M/DM La résolution mesure l’aptitude d’un spectromètre à séparer l’ion M de l’ion M+ΔM

10 Introduction de l’échantillon
Les différents éléments d’un spectromètre de masse : Système d’introduction de l’échantillon → faire entrer la substance M à analyser dans le spectromètre de masse Source d’ions → produire des ions et les extraire en phase gazeuse, Interface → focaliser et transmettre les ions vers l’analyseur Analyseur → trier les ions en fonction de leur rapport masse/charge Détecteur → recueillir les ions séparés par l’analyseur pour produire un courant électrique proportionnel au nombre d’ions SOURCE INTERFACE ANALYSEUR Introduction de l’échantillon Détecteur Ions

11 Sources d’ionisation Ionisation EI (Electronical Impact) Ionisation CI (Chemical Ionisation) Ionisation FAB (Fast Atom Bombardment) Ionisation LSI (Liquid Secondary Ion) Ionisation LD (Laser Desorption) Ionisation ES (electrospray) Ionisation MALDI (Matrix Assited Laser Desorption Ionisation) Petites molécules volatiles et non thermosensibles « méthodes dures » molécules < 6000 Da « méthodes dures » Biomolécules (1 300 kDa) et complexes non-covalents « méthodes douces »

12 Analyseurs Analyseurs Résolution Gamme m/z Quadripôle (Q) Magnétique (EB) Temps de vol (TOF) Trappe ionique Cyclotron à résonance des ions (FT-ICR)

13 Spectromètres de masse commerciaux
Q BE TOF IT FT-ICR EI/CI FAB MALDI/LD ES/APCI

14 La Spectrométrie de Masse Electrospray
Conditions à remplir pour analyser une espèce par ESI: - Espèce à étudier soluble dans un solvant usuel, - Espèce pré-chargée en solution NEUTRES Information généralement attendue en ESI: - Mesure de masse entière Méthode « DOUCE »

15 Principe de l’ionisation électrospray (ES)
J.B. Fenn (1988)

16 L’INTERFACE d’un spectromètre ESI (transmettre et focaliser les ions)
3 zones successives de pompage 10-6 mbar P atm 4000 Volts Hexapôle ………… TOF Vc RF Durée de st. 3 paramètres à contrôler

17 Comment s’ionisent les espèces à étudier ?
par protonation ou déprotonation, par cationisation (Na+, K+,…), par perte successive de contre-anions (PF6-, BF4-,….)

18 Particularité de la source ESI ?
Production d’ions multichargés 559 560 561 562 563 564 565 566 m/z 100 % Z = 3 1 Da Chaque pic isotopique est séparé par 0,33 m/z; c’est donc un ion 3+ 300 1000 m/z

19 Spectre ESI-MS de la myoglobine de cœur de cheval
707.1 737.3 771.7 808.2 848.6 893.2 942.8 998.1 Abondance Relative % m/z 20 + 17 + 22 + M = Da [M+20 H+] 20+ [M+19 H+] 19+ [M+21 H+] 21+

20 Etude de supramolécules synthétiques:
complexes non-covalents chimiques Ex: grille [4 X 4] de Pb(II) 2000 3000 5+ 6+ 7+ 8+ 9+ 100 Relative Abundance, % m/z 3061.0 2526.1 2143.9 1857.3 1634.3 MM = 16050,9 Da (Spectre de masse ESI: Vc = 20V, CH3CN, 10-4 M)

21 Etude d’un dimère de protéines: MM = 63540 Da
16+ 3200 3500 3800 m/z 15+ 17+ = complexe protéine/protéine

22 Spectre ESI d’un 18C6 en présence de cations alcalins
NEUTRE !


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