A maize resistance gene functions against bacterial streak disease in rice B. Zhao, X.Lin, J.Poland, H.Trick, J.Leach, S.Hulbert PNAS, octobre 2005.

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1 A maize resistance gene functions against bacterial streak disease in rice B. Zhao, X.Lin, J.Poland, H.Trick, J.Leach, S.Hulbert PNAS, octobre 2005

2 Maladie des stries bactériennes Xanthomonas oryzae pv oryzicola Xanthomonas oryzae pv oryzicola Présent en Asie et Océanie Présent en Asie et Océanie Stomate ou plaie Stomate ou plaie Bande internervaire étroite noire verdâtre en bordure des feuilles Bande internervaire étroite noire verdâtre en bordure des feuilles Aucun gène de résistance connu Aucun gène de résistance connu

3 Moyens de lutte Gène de résistance Gène de résistance codant pour protéines reconnaissant un pathogène et induisant une défense rapide et efficace : HR (r° hypersensible) pas durable car pathogènes développent résistances Résistance non-hôte Résistance non-hôte résistance protégeant une espèce donnée des pathogènes hôte d’une autre espèce conduisant à la destruction des barrières physiques, l’acc de sbces antibactériennes et la HR limitée car peu de connaissance sur les gènes contrôlant les Rces et possibilité de perte de fonctions lors du transfert à des espèces éloignées limitée car peu de connaissance sur les gènes contrôlant les Rces et possibilité de perte de fonctions lors du transfert à des espèces éloignées

4 Objectifs de l’étude Etude précédente Etude précédente –La Rce nonhôte du maïs est sous le contrôle d’un seul gène Rxo1 –X.o.pv.oryzicola porte avrRxo1 codant pour une protéine effectrice de type III sévère HR Objectifs de l’étude Objectifs de l’étude –Isoler Rxo1 chez le maïs : Utilisation de PIC19(NBS-LRR) comme sonde Utilisation de PIC19(NBS-LRR) comme sonde Essais d’expression transitoire et stable chez le maïs Essais d’expression transitoire et stable chez le maïs –Déterminer, si après transfert, Rxo1 conserve ses fonctions

5 Isolement de Rxo1 chez le maïs PIC19 = marqueur caractérisant la région portant Rxo1 PIC19 = marqueur caractérisant la région portant Rxo1 Obtention de 3 familles dérivées de B73(Rxo1) et Mo17(rxo1) Obtention de 3 familles dérivées de B73(Rxo1) et Mo17(rxo1) Rq : identification de 3 individus ne possédant pas les mêmes fragments de restriction, evmnt de Rq : identification de 3 individus ne possédant pas les mêmes fragments de restriction, evmnt de recombinaison à l’intérieur de la région recombinaison à l’intérieur de la région portant la famille de gène portant la famille de gène HR Le profil de restriction de B73 correspond à la HR médiée par Rxo1

6 Isolement de Rxo1 chez le maïs Criblage BAC du maïs construite à partir de B73, avec la sonde PIC19 Criblage BAC du maïs construite à partir de B73, avec la sonde PIC19 5 séquences hybridées par PIC19 sont clonées puis séquencées 5 séquences hybridées par PIC19 sont clonées puis séquencées 5 gènes : 5 gènes : –Paralog 1 : P typique céréale, protéine NBS-LRR –Paralog 5 : 85% d’identité avec P1 RT-PCR : Paralog 1 le + transcrit RT-PCR : Paralog 1 le + transcrit Analyse des produits de RT-PCR : paralog 4 et 5 aussi transcrits Analyse des produits de RT-PCR : paralog 4 et 5 aussi transcrits Structure du locus de Rxo1

7 Isolement de Rxo1 chez le maïs Analyse de la séquence après amplification par PCR des fragments de restriction Analyse de la séquence après amplification par PCR des fragments de restriction –2 ind : 5 fragments : paralog 3,4 et 5 de B73 et 2 gènes dérivés de Mo17 –1 ind : 3 fragments : paralog 1 et 2 de B73 et 1 gène dérivé de Mo17 1 des gènes de Mo17 probablement allélique du paralog1 pas les 2 autres 1 des gènes de Mo17 probablement allélique du paralog1 pas les 2 autres Examen des descendants n’ayant pas le même profil de restriction Pendant la méiose, réassortiment de la région portant Rxo1, phénomène démontré pour 2 autres loci de résistance Probablement la norme pour les familles de gènes R

8 Isolement de Rxo1 chez le maïs Essai de transformation transitoire Essai de transformation transitoire Démontrer que le paralog 1 contrôle le phénotype Rxo1 Constructs Average number of GFP fluorescence foci per cm 2 (+/- SE) Maize leaf (Mo17; rxo1)Rice leaf (Nipponbare) 35S-Rxo1 + HBT-GFP-TYG + Ubi-GUS36+/-9.523.4+/-4.4 PIC19-1 + HBT-GFP-TYG + Ubi-GUS42.2+/-7.724.5+/-5.1 35S-Rxo1 + HBT-GFP-TYG + 35S-avrRxo17.7+/-2.48.8+/-2.7 PIC19-1 + HBT-GFP-TYG + 35S-avrRxo112.2+/-3.312.9+/-1.9 Promoterless PIC19-1 + HBT- GFP-TYG + 35S-avrRxo137.6+/-526.1+/-5.5 Seul paralog 1 réduit le gène rapporteur La suppression du gène rapporteur est dépendante de avr-rxo1 par interaction avec Rxo1 Résultats semblables obtenus chez le riz

9 Vérification que le paralog 1 correspond à Rxo1 Maïs transgénique HiII(Rxo1) produisant 2 brins d’ARN provenant du paralog1(pRNAi-PIC19) Maïs transgénique HiII(Rxo1) produisant 2 brins d’ARN provenant du paralog1(pRNAi-PIC19) Le phénotype Rxo1 est conféré par un membre de la famille de gène PIC 19 HR + - HiII

10 Isolement de Rxo1 chez le maïs Transformation stable par biolistique transgène exprimant le paralog 1 Transformation stable par biolistique transgène exprimant le paralog 1 Hi3 (rxo1)+ paralog 1 Hi3 (rxo1)+ paralog 1 NT T Le transgène Rxo1 conditionne la HR, transformation stable HR

11 Gène Rba1 confère une résistance à Burkholderia andropogonis + Gène Rba1 confère une résistance à Burkholderia andropogonis + maïs transgénique Rxo1 + B.andropogonis HR maïs transgénique Rxo1 + B.andropogonis HR Rba1 et Rxo1 sont les mêmes gènes, paralog 1= Rxo1 Rba1 et Rxo1 sont les mêmes gènes, paralog 1= Rxo1 Capacité d’1 gène à conférer une résistance à 2 pathogènes ≠ Capacité d’1 gène à conférer une résistance à 2 pathogènes ≠ Le produit de Rxo1 reconnaitrait les perturbations causées par les bactéries Le produit de Rxo1 reconnaitrait les perturbations causées par les bactéries

12 Test de la fonction de Rxo1 chez le riz Transformation médiée par Agrobacterium Transformation médiée par Agrobacterium T NT HR Corrélation entre la HR et la présence de Rxo1 HR + -

13 Test de la fonction de Rxo1 chez le riz Vérification que le transgène fonctionne dans un mode gène pour gène Vérification que le transgène fonctionne dans un mode gène pour gène avrRxo1 HR dépend de la reconnaissance de avrRxo1 Inhibition de la multiplication par Rxo1 Effet similaire de Rxo1 chez le riz et le maïs avec f°mt gène pour gène Egalement, inhibition de la x° de B.andropogonis

14 Discussion Gènes de type NBS-LRR peuvent être transférés à des céréales très éloignées mais certains gènes ne fonctionnent pas ou possèdent une restriction taxonomique Gènes de type NBS-LRR peuvent être transférés à des céréales très éloignées mais certains gènes ne fonctionnent pas ou possèdent une restriction taxonomique Impact significatif dans les stratégies de lutte, ces gènes = 1% génome du riz Impact significatif dans les stratégies de lutte, ces gènes = 1% génome du riz gd réserve potentielle de gènes pour le contrôle de phytopathogènes gd réserve potentielle de gènes pour le contrôle de phytopathogènes  Meilleur compréhension de ces gènes permettrait de stabiliser les systèmes agricoles

15 Conclusion  Gène Rxo1 est l’un des composant de la Rce non hôte à X.oryzae pv oryzicola  Utile pour le contrôle des maladies