P. EHSANI1, A. MEUNIER2, F. NATO2, I. OLD2, A. JAFARI1, S

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1 P. EHSANI1, A. MEUNIER2, F. NATO2, I. OLD2, A. JAFARI1, S
P. EHSANI1, A. MEUNIER2, F. NATO2, I. OLD2, A. JAFARI1, S. DARTEVELLE2, J.-C. MAZIE2, G. DUCREUX3, P. LAFAYE2, A. NATO3 EXPRESSION DE FRAGMENTS SCFV ANTI-CYTOKINE PAR DES VITROPLANTS DE NICOTIANA TABACUM CV XANTHI 1 Molecular Biology Unit, Institut Pasteur, Avenue Pasteur, Téhéran (Iran) 2 Laboratoire Ingénierie des Anticorps, Institut Pasteur, rue du Docteur Roux, Paris Cedex 15 (France) 3 Laboratoire Morphogenèse Végétale Expérimentale, Bât. 360, Université Paris XI, Orsay Cedex (France)

2 Le groupe de travail

3 Objectif du projet Produire des fragments d’anticorps de type scFv anti-cytokine humaine (IL-4 ou IL-6) chez Nicotiana tabacum cv Xanthi  Elaborer un test ELISA permettant de déterminer la concentration en cytokines des fluides corporels pour le diagnostic de nombreuses pathologies humaines (réaction inflammatoire, allergies…).

4 Structure générale d’une immunoglobuline
Fab Fv CDR VH VL CH2 CH1 CH3 CL S-S Fc

5 Structure des fragments d’anticorps
Papaïne Pepsine Génie génétique

6 Pourquoi un végétal comme bioréacteur ?
Les plantes transgéniques constituent un système alternatif à la production de protéines eucaryotes et notamment d’anticorps grâce :  au faible coût de production de la biomasse végétale,  à l’absence de risque de contamination par des pathogènes humains,  à une plus grande conformité de la protéine recombinée avec la protéine naturelle,  à l ’existence d’infrastructures de récolte, de stockage et d’extraction.

7 RB : Extrémité droite ; RB : Extrémité droite ;
Quelle construction génétique a été réalisée ? RB : Extrémité droite ; RB : Extrémité droite ; LB R P VL VH scFv C-myc tag T RB LB : Extrémité gauche RB : Extrémité droite R : Gène sélectif de résistance (nptII) P : Promoteur (CaMV 35S) scFv : Fragment variable simple chaîne c-myc-tag : peptide tag T : Terminateur (3 ’ocs)

8 La transformation végétale

9 Disques foliaires de tabac en pré-culture
Régénération d’une plantule entière Début d’organogenèse sur des disques foliaires de tabac, 4 semaines après la transformation par Agrobacterium Plantule de tabac transformée à partir d’un disque foliaire, 8 semaines après la transformation par Agrobacterium Disques foliaires de tabac en pré-culture

10 Caractéristiques physiologiques des vitroplants
Résultats (1) Quantification des protéines solubles totales de vitroplants de Nicotiana tabacum âgés de 45 jours. Dégradation des protéines et accélération de la sénescence foliaire. Vitroplant de tabac transformé Tabac transgénique après 3 semaines en serres IL-6 Témoin IL-4 Caractéristiques physiologiques des vitroplants Expression d’un processus de floraison hâtive sur les vitroplants et plantes acclimatées en serres (En serres, 3 semaines au lieu de 8, pour la plante non transformée).

11 Caractéristiques biochimiques des vitroplants
Résultats (2) Tableau récapitulatif des résultats obtenus pour l’expression des fragments scFv anti-cytokine chez Nicotiana tabacum. Faible proportion de plantules produisant le scFv anti-IL-4 en comparaison des anti-IL-6. Présence d’une double bande aux environs de 30 kDa, taille correspondant à celle attendue du scFv anti-cytokine. 35 50 21 29 kDa PM F R T Immuno-transfert d’extraits protéiques foliaires (F) et racinaires (R) de tabacs transformés (3 clones anti IL-6) et non transformés (T). PM 2 1 5 3 4 8 7 6 T 32,5 47,5 16,5 25 6,5 kDa Immuno-transfert d’extraits protéiques de tabacs transformés (IL-6 : 1, 2, 3 ,4 ; IL-4 : 5, 6, 7, 8) et non transformés (T). Caractéristiques biochimiques des vitroplants Accumulation beaucoup plus importante des fragments d’anticorps de type scFv anti IL-6 dans les racines que dans les feuilles.

12 Discussion et perspectives (1)
10 fois moins de plantules IL-4 que d’IL-6 avec des différences morphologiques importantes (fragilité, jaunissement des feuilles...).  Hypothèse : les scFv interfèrent sur le métabolisme général de la plante. Tests ELISA :  Conformation correcte des scFv anti IL-4 et anti IL-6. Estimation quantitative, par Western Blot :  Les scFv représentent environ 1% des Protéines Solubles Totales ce qui correspond aux résultats (entre 1 à 2% des PST) obtenus par de nombreuses équipes (Conrad et Fiedler, 1998 ; Ma et al., ).

13 Discussion et perspectives (2)
Immuno-transferts :  L’accumulation au niveau des racines laisse présager un pourcentage d ’expression supérieur à ceux déjà observés. Travaux en cours :  purification par chromatographie d’affinité des scFv anti-cytokine, présents dans les extraits végétaux,  réalisation d’une nouvelle construction génétique avec la séquence KDEL (Conrad et Fiedler, 1998),  transformation d’autres espèces végétales : la pomme de terre, Solanum tuberosum et l ’aubergine, Solanum melongena.