1 Tetrahymena Etudes de protéines durant un stress toxique par immunodétection.

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1 1 Tetrahymena Etudes de protéines durant un stress toxique par immunodétection

2 Diapo # 2 Buts à long terme Comprendre les mécanismes moléculaires de réponse aux produits toxiques, chocs oxydatifs et autres "stress chimiques" Trouver des marqueurs potentiels de toxicité Evaluation de la qualité de l'eau Evaluation de la toxicité de produits chimiques QSAR

3 Diapo # 3 Objectifs du projet Identifier la protéine 32 k par immunodétection Déterminer les paramètres d'induction de cette protéine Cinétique Concentration de toxique Type de toxiques Synergie Etc.

4 Diapo # 4 Objectifs du projet (alternatives) Identification par PCR Identifier gène dans génome Tetrahymena Définir sonde spécifique Obtenir sonde Développer protocole Résultat négatif => ????

5 Diapo # 5 Culture des cellules… Culture stock Culture de conditionnement Culture de travail Incubations

6 Diapo # 6 Traitements… Contrôle Choc thermique Toxiques/stress Concentration, durée, cinétique Toxiques, Stress oxydatif, inhibiteurs

7 Diapo # 7 Incubations… 2.5 x 10 5 cell/mL Volume total : 1 mL Durée: 45 min Milieu culture: Contrôle: Aucun toxique = - 34°C (choc thermique) = +

8 Diapo # 8 Extraction des protéines… SDS ou phénol

9 Diapo # 9 Electrophorèse… Système de Laemlli (SDS) Gels 5%/12.6% Electrobuvardage Semi-sec Nitrocellulose ou PVDF

10 Diapo # 10 Immunodétection Ab secondaire conjugué phosphatase alc. Détection chromogénique ou chémifluorescence Etalons: Contrôle interne: actine Ag: actine, 32k (rat),

11 Diapo # 11 Autres protéines intéressantes Métallothioénine GRP76 HSP….