Jean-Pierre Wauters Berne Université d‘été – SFD Nîmes Juin 2004

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1 Jean-Pierre Wauters Berne Université d‘été – SFD Nîmes Juin 2004
Le biofilm en dialyse Jean-Pierre Wauters Berne Université d‘été – SFD Nîmes Juin 2004

2 Le biofilm en SEM

3 Le biofilm en dialyse Plan de l‘exposé 1. Définition
2. Mécanisme de formation 3. Diagnostic 4. Hémodialyse et Dialyse Péritonéale 5. Prévention et Traitement

4 1. Définition du biofilm A. Van Leeuwenhoek 17ème siècle
plaque dentaire De 1980 à aujourd‘hui : = une communauté structurée de cellules microbiennes inclue dans une matrice de polymères autoproduite adhérente à une surface inerte ou vivante et impliquant une modification phénotypique.

5 1. Définition du biofilm Les propriétés des bactéries isolées ou inclues dans un biofilm diffèrent : vitesse de croissance organisation interne résistance aux agents anti-infectieux : transport intra-matriciel, adsorption, croissance et modification cellulaires transcription génétique des facteurs d‘adhésion et de production de matrice

6 1. Constitution du biofilm
1. Organismes (~15% vol) Bactéries gram + Staph. epidermidis, Staph. aureus, Strepto. viridans, Enterocoque faecalis, ... Bactéries gram – E. coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, ... Champignons Candida albicans, ... 2. Matrice extracellulaire (~85% vol) polymère de polysaccharides, protéines 3. Canaux liquidiens

7 2. Mécanisme de formation
Dasgupta MK Seminars Dialysis 2002

8 2. Mécanisme de formation
Nécessité pour les bactéries de pouvoir : 1. produire des attaches (pili type 1) 2. se mouvoir à l‘aide de flagelles 3. initier la sécretion des composants de la matrice 4. constituer des canaux entre les colonies cellulaires („système circulatoire primitif“) 5 différencier leur activité physiologique en fonction de la profondeur des couches cellulaires

9 2. Mécanisme de formation
Facteurs de développement : I. Lors de l‘adhésion cellulaire : Type et nombre cellulaire Temps de contact, flux liquidien (turbulent) Propriétes physico-chimiques de la surface de contact Expression génétique de composants microbiens régulant l‘adhésion cellulaire, la formation du biofilm et la non-prolifération.

10 2. Mécanisme de formation
Facteurs de développement : II. En phase de croissance : Flux liquidien Apport nutritif Température Concentration substances anti-microbiennes Echange de signaux inter-cellulaires, “quorum sensing„

11 Formation du biofilm un modèle expérimental
Enterobacter cloacae biofilm sur connecteur Donlan RM Emerging Infect Dis 2001

12 2. Mécanisme de formation
Vitesse de formation 8 semaines sur acier inox Donlan RM Emerging Infec Dis 2002

13 2. Mécanisme de formation
Alors que les bactéries isolées sont atteignables par les anticorps, les phagocytes et les antibiotiques, les bactéries adhérentes à un biofilm y sont résistantes Les phagocytes attirés par le biofilm relâchent des enzymes phagocytaires („phagocytose frustrée“) ; ces enzymes lèsent les tissus avoisinants et des bactéries sont relachées du biofilm Ce relargage peut causer une dissémination microbienne et une infection aigue récurrente.

14 2. Résistance aux antibiotiques
Phénotype planctonique vs. phénotype biofilm CMI CMI (microg/ml) S. aureus vancomycine Pseudomonas aer imipenem 1 >1‘000 E. coli ampicilline P. pseudomalei ceftazidime Strepto sanguis doxycycline Donlan RM, Costerton JW. Clin Microbiol Rev. 2002; 15:

15 Résistance aux antibiotiques Stewart P et al. Lancet 2001

16 2. Du biofilm à la maladie Surtout chez les patients immunocompromis
Par détachement cellulaire Nombre de colonies, force de cisaillement, concentration du substrat (acyl-homoserine lactone) Production d‘endotoxines Syndrome inflammatoire Résistance au système immunitaire Matrice extra-cellulaire et résistance à la phagocytose Résistance aux radicaux libres Développement de bactéries résistantes Echange de plasmides

17 2. Du biofilm à la maladie l‘exemple du cathéter i.v.
Raad I. Lancet 1998

18 2. Du biofilm à la maladie Infections humaines (1):
Carie et plaque dentaires Otite moyenne Endocardite Infections musculo-squelettiques (fascéite nécrosante, ostéo-myélite,...) Prostatite Fibrose kystique

19 2. Du biofilm à la maladie Infections humaines (2): Infections nosocomiales Valves cardiaques prothétiques Cathéters veineux centraux, endoprothèses et shunts artério-veineux Cathéters urinaires Lentilles de contact Stérilets intra-utérins Implants orthopédiques Production d‘eau unités soins dentaires et hémodialyse Cathéter de DP ...

20 3. Diagnostic Contexte clinique
Si cathéter, hémocultures par paires : au site suspecté et au niveau veineux Mise en évidence du biofilm : Visualisation : microscopie electronique (confocal laser scanning microscope) Etude du matériel : comptage sur plaque après prélevement mécanique, sonication, brossage endoluminal, ...

21 Biofilm Confocal laser scanning micrography
Donlan RM et Costerton JW. Clin Microbiol Rev 2002

22 3. Diagnostic Methodes de mise en évidence de biofilms sur des cathéters : Roll-plate Vortex Sonication, vortex Coloration directe par acridine orange Brossage endoluminal Alginate swab Milieux de culture: PBS (phosphate-buffered saline), TSB (Trypticase soy broth).

23 3. Diagnostic Milieux de culture adéquats

24 3. Diagnostic Marion K.et al. Artif Organs 2003

25 4. Biofilm et hemodialyse
Accès vasculaire Générateurs de dialyse Ultrafiltres

26 4. Biofilm et hemodialyse
Accès vasculaire Facteurs de risque 1. cathéters : PVC Teflon hétérogreffes: PTFE 2. manipulations Formation du biofilm intra- et extra-luminal en 1-14 jours après insertion Staph epi, S. aureus. Candida,… Résistance aux antibiotiques

27 4. Biofilm et hemodialyse
Accès vasculaire Importance du contact sanguin E. cloacae P. agglomerans Murga et al. J Clin Microbiol 2001

28 4. Biofilm et hemodialyse
Générateurs de dialyse L‘ensemble du système hydraulique L‘eau d‘hémodialyse et son traitement Le rôle des flux La résistance aux agents inti-infectieux et aux procédures de dèsinfection

29 Recommandations microbiologiques pour l‘eau d‘hémodialyse
AAMI Ph E Eau ultra-pure CFU < U/ml 200 100 0.1 Endotoxin 5 (2) 0.25 0.03

30 Biofilm et hémodialyse
Variations de la qualité de l‘eau pour HD Origine : surface, source,.. Lieu géographique Variations saisonnières Type de traitement exposition directe du sang à 15‘000-30‘000 L/an

31 4. Biofilm et hemodialyse
Donlan RM, Costerton JW. Clin Microbiol Rev 2002

32 Stades de formation du biofilm
A 7 jours B 14 j C 30 j Marion K et al Artif Organs 2003

33 Biofilm et hémodialyse
Man NK et al. Artif Organs 1998 Prélèvement de tubulures en silicone sur circuit eau, concentré bicarbonate et dialysat de 3 générateurs de dialyse 2-4 ans Analyse microbiologique après US comparée aux bactéries et endotoxines dans le dialysat Etude par SEM

34 Biofilm et générateurs d‘hémodialyse
Man NK et al. Artif Organs 1998

35 Biofilm et générateurs d‘hémodialyse
Man NK et al. Artif Organs 1998

36 Man NK et al. Evidence of bacterial biofilm in tubing from hydraulic pathway of hemodialysis system. Artif Organs 1998; 22:

37 Man NK et al. Evidence of bacterial biofilm in tubing from hydraulic pathway of hemodialysis system. Artif Organs 1998; 22:

38 Qualité microbiologique de l‘eau pour hémodialyse
Pensez-vous que la qualité microbiologique de l‘eau de votre centre de dialyse réponde aux exigences de la Pharmacopée européenne (< 100 U/ml) ? N= 2‘400 EDTA-ERA 1997 NDT 1998 Oui, j‘en suis sûr 60 % Oui, je pense 27 % Je crains que non 8 % Non, j‘en suis sûr 5 %

39 Qualité microbiologique de l‘eau pour hémodialyse
Hoenich et al centres 14 pays CE Sem Dial 2002 50% effectuent les contrôles Bambauer et al. 30 centres RFA Asaio J 1994 17% CFU et 27.5% EU > normes Oie et al. 9 centres Japon J Hosp Infect 2003 42% CFU> normes Pontoriero et al. 25 centres Italie (Lombardie) NDT 2002 15% CFU > normes

40 Qualité microbiologique de l‘eau pour hémodialyse

41 Etude évaluation qualité en Suisse Romande Contrôle du traitement de l’eau
Mars centres 617 patients N = 20 centres Préparation d’eau autonome 15 Centres Filtration mécanique 13 Filtre charbon actif 13 Décalcificateur Osmose inverse 20 Rayons UV Procédures de dèsinfection tous sauf 1 centre

42 Contrôles microbiologiques: Contrôles chimiques:
Etude évaluation qualité en Suisse Romande Contrôle du traitement de l’eau Contrôles microbiologiques: 12 x/an 8 centres 6 x/an 1 centre 4 x/an 3 centres 2 x/an 5 centres 1 x/an 1 centre 0 x/an 1 centre N.B: 1 seul épisode > 200 col/ml l'année dernière pour l’ensemble des centres. Contrôles chimiques: 12 x/an 1 centre 6 x/an 1 centre 4 x/an 2 centres 2 x/an 5 centres 1 x/an 3 centres (AAMI) 0 x/an 7 centres

43 4. Biofilm et hemodialyse
Ultrafiltres dans circuit dialysat Utilité pour diminuer la contamination Recommendations variables : changement après 30 à 90 jours selon les fabricants Contamination favorisée par flux discontinu, filtre charbon actif,... Qualité du concentré (bicarbonate,..)

44 Tubulure générateur 24 sem Unité A : RO, dèsioniseur, UV, ozone 1x sem
Penders C et al. Nephrol Dial Transplant 2001

45 Tubulure sortie eau-générateur 24 sem Unité B: « traitement standard »
Penders C et al. Nephrol Dial Transplant 2001

46 Qualité microbiologique de l‘eau pour hémodialyse Quality of water used for haemodialysis Vorbeck-Meister I. et al. Nephrol Dial Transplant 1999; 14 : 7 centres de dialyse en Autriche H2O non traitée Avant RO Après RO Entrée généra-teur Sortie généra-teur CFU 22° >100/ml 25% 66% 33% 10% 50% 37° Endotoxin >0.25 U/ml 0.56->9.49 <0.03 57%

47 Qualité microbiologique de l‘eau pour hémodialyse
Hoenich NA et al. Sem Dial 2003 Résultats 6 mois après upgrade dans 4 centres N=342 Avant amélioration traitement eau Après amélioration traitement eau Hb (g/l) 109+14 113+12 EPO (U/mois) 85’800 82’500 Albumin (g/l) Creatinine (mg/dl) CRP 14.3 12.2

48 4. Biofilm et dialyse péritonéale
Très frequent Causes favorisantes Orifice cutané, cathéter, liquide péritonéal, manipulations,... Germes habituels S. aureus, S.epi, Pseudomonas, E. Coli Clinique Péritonites recurrentes, infections de l‘orifice ++ Modèle expérimental : MRD modified Robbins device = culture du dialysat effluent sur silastic

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50 5. Prévention et traitement du biofilm
Dasgupta MK Seminars Dialysis 2002

51 5. Prévention et traitement du biofilm
Principe général : Plutôt prévenir et /ou traiter la structure multicellulaire que les cellules individuelles prévenir les dépôts microbiens diminuer l‘attachement microbien de surface pénétrer le biofilm et détruire la structure de la matrice et /ou les cellules enlever ou remplacer le matériel contaminé.

52 5. Prévention du biofilm I. Rôle de la contamination cutanée
Dépistage et traitement des porteurs de Staph. Aureus Conditions d‘aseptie lors de la mise en place du cathéter Soins chroniques de l‘orifice de sortie du cathéter En HD fistule CB plutôt que cathéters En DP systèmes de connection automatique implantation du cathéter selon la technique Popovich-Moncrief

53 5. Prévention du biofilm II. Rôle du matériel de cathéter
Cathéters coatés : hydroxy-apatite argent, argent et chlorhexidine Verrou antibiotique III. Rôle du dialysat DP : glucose; icodextrine, ac. aminés,...? HD : circuit hydraulique, type de membrane, diamètre des tubulures, flux, qualité de l‘eau et du dialysat utilisée,...

54 5. Prévention du biofilm en hémodialyse
Traitement optimal de l‘eau RO, filtres, UV, tubulures courtes, diamètre faible (vélocité flux), dèsinfection régulière Dèsinfection du générateur selon programme périodique Vérification et/ou remplacement régulier des tubulures en zone fragile (liquide stagnant, zone non dèsinfectée, valves...)

55 5. Prévention du biofilm en hémodialyse
Perez-Gomez R. et al. Nephrol Dial Transplant 2000 Editorial Comment : Why and how to monitor bacterial contamination of dialysate? Où ? Entrée eau, avant osmoseur, après osmoseur, avant générateur, entrée filtre Comment ? Prélèvement (récipient apyrogène, large volume), transport 4°, culture sur R2A à 37° et 22°, recherche endotoxine par LAL A quelle fréquence? 1 x mois ou plus si problème clinique ou résultat positif.

56 5. Prévention du biofilm Rôle du traitement de l‘eau
Smeets et al. Kidney Int 2003 Etude 2 centres HD A RO CFU 350 /L B RO+dèsioniseur+UV +ozone 1x/sem CFU 1/L A B CFU >100/ml 16% 3% Endotoxine > 0.5/ml 76% 0% Biofilm SEM 92% 1

57 5. Prévention du biofilm Rôle du traitement de l’eau Centre A Centre B
Smeets et al. Kidney Int 2003

58 Biofilm et qualité de l‘eau Médecine Dentaire
Kettering JD et al. J Contemp Dental Pract 2002

59 Biofilm et hémodialyse
Cappelli et al. Nephrol Dial Transplant 2003 Etude comparative des methodes de dèsinfection des générateurs Suspension Pseudomonas pendant 1h. dans circuit dialysat Après 72 h, rinçage, contrôle par SEM présence biofilm et dèsinfection CFU /ml hypochlorite ac. peracétique chaleur chaleur + ac. citrique idem + 60 h ac. peracét. 0 h. 177 97.5 112.5 6.3 1.5 24 h. 1575 255 1550 14.3 1.6 48 h. 5675 900 5250 66 1.7 72 h. 6000 1462 9250 72 x30 x15 x80 x10 x0

60 5. Traitement du biofilm Pénétration du biofilm
Rôle rifampicin + activité synergique Aminosides, ciprofloxacin > imipenem, ceftazidime, vancomycine, oxacillin Agents thrombolytiques : streptokinase, urokinase,... Verrou antibiotique

61 5. Traitement du biofilm Balaban et al. Kidney Int 2003
Rôle RNA III inhibiting peptide (RIP) interfère avec les mécanismes de communication inter-cellulaire lors du quorum sensing Isolation de souches de S. aureus c/o 20 patients débutant hémodialyse Etude adhérence sur cathéters de dialyse in vitro après incubation avec/sans RIP RIP . diminution du nombre de bactéries attachées . diminution de la surface d‘adhésion (4x) Confirmation in vivo sur héterogreffe c/o le rat Coating des cathéters par RIP ??

62 Effet d’un inhibiteur de l’urease sur
l’incrustation de catheters urinaires Morris NS et al. Urol Res 1998

63 5. Traitement du biofilm Ablation ou remplacement du matériel infecté
le plus souvent le seul traitement efficace

64 Le biofilm en dialyse Conclusions
Penser au biofilm en toutes circonstances /=dépots inertes non-structurés de cellules et de matrice mais = communauté complexe de cellules et d‘une matrice avec genotype propre et en interaction constante avec le milieu qui peut induire des réactions aigues et un état inflammatoire chronique chez le patient.

65 Le biofilm en dialyse Conclusions
2. Mettre en oeuvre les méthodes de prévention adéquates : - conception unitaire des circuits hydrauliques, générateur et traitement de l‘eau “court et simple„ - installation de microfiltres sur chaque générateur - programmes de dèsinfection protocolés - contrôles microbiologiques réguliers selon critères et méthodologie reconnus

66 Le biofilm en dialyse Conclusions
3. Mettre sur pied une équipe “Traitement de l‘eau„ comprenant : médecin et infirmière responsables, pharmacien, ingénieur-technicien de l‘eau, laboratoire de contrôle. Cette equipe gère les directives de maintenance et de contrôles (et ses résultats) en appliquant un contrôle de qualité périodique.