Correction du feuillet de TD exo

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1 Correction du feuillet de TD exo-3-4-5-6-7
 -Exercice 3- Le tableau ci-dessous présente les propriétés de la molécule d'IgG entière et de ses différents fragments. Insérer un (+) si la molécule ou une partie de celle-ci présente la propriété, et un (-) si elle ne l'a pas.

2 propriétés IgG chH chL Fab F(ab’)2 Fc Se lie à l’Ag (liaison minimum univalente) + - Liaison divalente à l’Ag Se lie aux Récepteurs du Fc Fixé au Ct en présence de l’Ag* A des domaines variables A des domaines constants *le premier élément de la cascade protéolytique d’activation du complément, le complexe C1 (il s’agit de la voie d’activation du complément dite « classique » c’est-à-dire dépendant de la présence des Ac) se fixe à deux fragments Fc de deux Ac fixés à proximité sur un Ag. Cette fixation a lieu si et seulement si il y a eu cette interaction Ag-AC spécifique car c’est seulement lorsque les Ac se sont fixés sur l’Ag qu’ils changent de conformation ; ce changement conformationnel libère alors au niveau de leur fragment Fc le site de fixation pour le complexe C1.

3 -Exercice 4- Où sont localisées les régions Hypervariables dans une molécule d'anticorps et quelles sont leurs fonctions ? Les régions HV 1,2 et 3 (hypervariables en français) ou CDR1,2 et 3 (complementary determining regions en anglais) se trouvent dans les domaines variables des chaînes lourdes et légères des Ig. Il y a trois régions variables par domaines variables: 3 pour VH , 3 pour VL, donc 6 régions HV pour un site de fixation à l’Ag. On a deux sites de fixations pour une Ig monomérique. Ces régions HV sont localisées dans les boucles formées par les deux feuillets b anti-parallèles exposés au niveau Nterminal des domaines globulaires VH et VL. Cf diapo de cours suivantes

4 régions Hyper Variables (HV) ou régions CDR : 5 à 6 aa.
Un anticorps est constitué de domaines immunoglobuliniques (séquence d’AA se repliant de manière caractéristique avec présence d’un pont diS intrachaîne) Boucle de 60 aa 110 aa en feuillets  s Comparaison de séquences: HV1 HV2 HV3 régions Hyper Variables (HV) ou régions CDR : 5 à 6 aa. 6 HV/site VL CL Chaîne L VH CH1 CH2 CH3 Chaîne H variabilité Complementary determining region

5 Structure quaternaire d’une immunoglobuline
Structure secondaire d’un domaine immunoglobulinique: exemple sur chaîne L Les 3 domaines HV sont sur les boucles formées à l’extrémité des brins des feuillets . Structure quaternaire d’une immunoglobuline Cristallographie rayons X 6 HV/site

6 Antigène Epitope = déterminant antigénique Paratope
Chaque site de fixation de l'Ag, composé de 6 HV réunies, définie le « Paratope » Ig entière et F(ab’)2 possèdent 2 sites de fixation = des Ac divalents Fab possède 1 site de fixation = un Ac monovalent VL HV1 HV2 HV3 Antigène Epitope = déterminant antigénique VH Paratope Les mutations affectant les régions HV du domaine variable modifient -uniquement le paratope c’est-à-dire le site de fixation de l’épitope -mais pas la structure de l’Ig codée par les autres régions du domaine, constituant le « framework » (ou séquence de base = résidus invariants) La région HV3 est la plus enfouie et c’est elle qui « rentre le plus en contact » avec le peptide qui vient se loger dans la poche formée par les 6 HV (cf exposé exo 5)

7 -Exercice 5- L'analyse cristallographique par rayons X de plus d'une douzaine de molécules d'anticorps liées à leurs antigènes respectifs a révélé que la région CDR3 (ou HV3) des chaînes lourdes, ainsi que celle des chaînes légères entre en contact avec l'épitope. De plus, l'analyse des séquences révèle que la variabilité de la région CDR3 (ou HV3) est plus grande que celle de la région CDR1(ou HV1) ou de la région CDR2 (ou HV2). Quel(s) mécanisme(s) explique(nt) la plus grande diversité de la région CDR3(ou HV3) ?

8 Pour répondre à cette question il convient de reprendre les trois sources de diversités des Ig:
1-la combinatoire VJ (chaîne L) et V-DJ (chaîne H), avec de nombreux segments V, D et J, par le biais des réarrangements (phénomène unique n’ayant lieu que dans les B pour la génération de leur BCR et les T pour leur TCR), impliquant les séquences RSS et les enzymes RAG 1 et 2. 2-la façon dont ces segments sont rapprochés et raboutés (ou reliés) ensemble qui crée de la diversité dite « jonctionnelle » Ces deux mécanismes ont lieu dans la moelle osseuse pour les B et dans le thymus pour les T (organes lymphoïdes primaires) dans lesquels ils effectuent leur maturation. Ils en sortent matures naïfs càd qu’ils n’ont pas encore rencontré l’Ag via leur BCR ou TCR fraîchement réarrangé. 3- l’autre source de diversité a lieu uniquement pour le BCR des cellules B dans les organes lymphoïdes secondaires où elles rencontrent leur Ag et sont activées par ce dernier (et avec l’aide des cellules Th en général), ce qui conduit à leur division rapide et l’apparition de mutations qui sont mal réparées= les Hypermutations somatiques. Elles contribuent à ce que l’on appelle la maturation de l’affinité de l’Ig (on le verra l’an prochain plus en détails). cf diapo de cours suivantes pour rappel de ces trois phénomènes.

9 A) Théories sur l'expression des gènes codant les Igs
Comment est généré le vaste répertoire des BCR ? A) Théories sur l'expression des gènes codant les Igs 1) Théorie de la lignée germinative: les Ig seraient codées par l’ADN non modifié des cellules germinales, 1 gène  1 protéine Théorie 1: impossible énergétiquement, 2) Théorie de la variation somatique: les cellules germinales possèdent de nombreux segments de gènes qui sont réarrangées dans les cellules somatiques. Théorie 2: théorique en 1965 et vérifiée en 1976 (prix Nobel 1987) Révolutionne la façon de penser en biologie!

10 B) Réarrangement/recombinaison génique:
les nombreux segments géniques =1er niveau de diversité Les domaines Variables des Ig (ou du BCR et du TCR) sont codés par une combinaison réalisée « au hasard » à partir de nombreux segments géniques. Les domaines C sont codés par 1 ou un petit nombre de segments. 110 aa Dom VL Nter Cter V J ADN Domaine VL Combinaison d’un segment V et d’un segment J Domaine VH Combinaison d’un segment V, d’un segment D et d’un segment J 110 aa Dom VH Nter Cter V J ADN D chez l’Homme VL (Chr 2) : 40 V, 5J VLl Chr 22 : 30 V, 4J V variable D diversity J joining VH (Chr 14) : 51 V, 27D, 6J chez l’Homme

11 Illustration chez la souris
Chaîne légère = un évènement de recombinaison génique de V vers J

12 Chaîne lourde = deux évènements de recombinaison génique De D vers J
Puis de V vers DJ

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14 2ème niveau de diversité
C) Réarrangement/recombinaison génique: le mécanisme de ligation des segments géniques induit de la « Flexibilité jonctionnelle » : 2ème niveau de diversité 1) Le réarrangement est déterminé par la présence de régions spécifiques: les régions RSS 2) Ces régions sont reconnues par des recombinases spécifiques: RAG-1 et RAG-2 Rapprochement, coupure db, formation de l’épingle à cheveux 3) Ouverture par une endonucléase de l’épingle à cheveux mais le site de coupure est variable: Ajout de nucléotides P ou/et N (TdT)  flexibilité jonctionnelle

15 Séquences signal de recombinaison (RSS)

16 Addition de nucléotides
 Modification/nouveaux codons = La flexibilité jonctionnelle, source de diversité Addition de nucléotides (chaine H) TC AG TA GA AT TCGA AGCT TATA ATAT P N raNdom TC TA AG P GA AT P TCGA TATA AGCT ATAT Exemple de la jonction V-J chaîne L TdT Terminal desoxyribonycleotidyl Transferase

17 *CDR3 codées par jonction V-J (chaîne L) et V-D-J (chaîne H)
-2/3 recombinaisons créent des codons Stop = recombinaison non productive (Ig non mature, le clone B meurt par apoptose) -1/3 viables (éventuellement Ig peu affine, clone B non sélectionné) -Ces mécanismes augmentant la diversité ont lieu au niveau des régions HV ou CDR (= régions reconnaissant l'Ag). *CDR1 et CDR2 codées par les segments géniques V *CDR3 codées par jonction V-J (chaîne L) et V-D-J (chaîne H) *CDR3 est la plus variable des régions HV

18 -Diversité combinatoire et Diversité jonctionnelle déterminent la spécificité de l’Ig pour un Ag
-Cette spécificité est acquise dans la MO lors de la maturation des LB pour toute la vie du clone B -Ces phénomènes génèrent un très large répertoire d’Ig -Encore élargi par la suite par les Hyper Mutations Somatiques (HMS), survenant lors de leur activation dans les OLS (organes lymphoïdes secondaires).

19 touchant indifféremment les régions CDR1, CDR2, CDR3,
D) Les Hyper Mutations Somatiques (HMS): 3ème niveau de diversité Mutations dans l’ADN des régions V lors de la prolifération du clone LB ayant été activé dans les OLS touchant indifféremment les régions CDR1, CDR2, CDR3, alors que la flexibilité jonctionnelle V(D)J touche la région CDR3 exclusivement. ADN V J D VH VL 1 clone LB 1ère immunisation 2ème immunisation Mutation Multiplication Elles augmentent l'affinité des Ig pour l'Ag = « maturation de l'affinité »

20 -Exercice 6- On vous a donné deux solutions, l'une contenant une protéine X et l'autre l'anticorps contre cette protéine. Lorsque vous ajoutez 1 mL d'anti-X à 1 mL de protéine X, un précipité se forme. Mais lorsque vous diluez la solution d'anticorps 100 fois et que vous mélangez alors 1 ml d'anti-X dilué et 1 mL de protéine X, aucun précipité ne se forme. Il s’agit d’une réaction d’immunoprécipitation en milieu liquide Il faut donc des prérequis (communs avec immunodiffusion et agglutinations, techniques nécessitant la formation d’ un réseau ou amas ou agglutinats) cf cours techniques d’immuno Formation d’un précipité= troubles floconneux = réseau visible; Pour cela il faut que les Ag sont réunis en bien plus grand nombre que deux par deux (cas des Ag monovalents) car pas observable à l’œil. Il faut : -Ag minimum divalent par rapport aux Ac présents dans le milieu -Ac divalent (donc Fab exclu) -être dans la « zone d’équivalence » définie comme une fourchette de concentration en Ac (déterminable par dilution sérielle de la solution d’Ac) qu’il faudra utiliser pour observer un amas en présence de l’Ag à une concentration donnée. Cf diapo cours suivante

21 Ainsi le mécanisme qui explique la plus grande diversité de la région CDR3(ou HV3) est la flexibilité jonctionnelle car cette diversité touche la région HV3 alors que les régions HV1 et HV2 sont déterminées uniquement par les segments géniques V et les HMS touchent aussi bien HV1, 2 et 3.

22 *Immunoprécipitation en milieu liquide
L'expérience consiste à répartir des quantités égales d'un sérum immun avec une solution d'un Ag multivalent en concentration croissante (on peut également fixer la concentration en Ag et faire varier la concentration en Ac spécifique). La zone d'équivalence correspond à la formation d'un réseau Ag-Ac (le point où la courbe atteint son maximum) . Formation d’un réseau Zone d’équivalence Dans cette illustration du cours c’est la concentration en Ag que l’on a fait varier

23 Précipité ou réseau Concentration fixe en Ag X Zone d’équivalence Zone excès en Ag Zone excès en Ac Tube 1 =1ml d’Ac anti-X +1ml de X=amas Tube 2 =1ml d’Ac anti-X au 1/100ème +1ml de X= pas d’amas Tube 1 Tube 2 Concentration en AC Dilution de l’Ac Expliquez pourquoi aucun précipité n'est formé avec l'anticorps dilué on est sorti de la zone d’équivalence cf schéma tube 2 ! b. Quelles espèces (protéine X ou anti-X) seraient vraisemblablement présentes dans le surnageant du mélange antigène-anticorps dans chaque cas. Tube 1 : aucune espèce en excès Tube 2: Ag en excès

24 -Exercice 7- En préparant une démonstration pour sa classe d'immunologie, un professeur a purifié des anticorps IgG contre les globules rouges du sang de mouton (GRM) et a digéré certains des anticorps en fragments Fab, Fc et F(ab)’2. Il a placé chaque préparation dans un tube séparé, marqué les tubes avec un marqueur hydrosoluble puis les a laissés dans la glace. Lorsque le professeur est revenu pour faire sa classe, il a découvert que les identifications avaient coulé et étaient illisibles. Déterminé à sauver la démonstration, il a marqué à nouveau les tubes 1, 2, 3 et 4 et a continué son travail. En vous appuyant sur les résultats des tests décrits ci-dessous, indiquer quelle préparation était contenue dans chaque tube et expliquer pourquoi vous identifiez ainsi les contenus. a. La préparation du tube 1 agglutinait les GRM, mais ne les lysait pas en présence du complément. b. La préparation du tube 2 n'agglutinait pas les GRM, ni ne les lysait en présence du complément. Cependant, lorsque cette préparation était ajoutée à des GRM avant l'addition de l'anti-GRM total, elle prévenait l'agglutination des cellules par l'antisérum anti-GRM total. c. La préparation du tube 3 agglutinait les SRBC et lysait aussi ces cellules en présence du complément. d. La préparation du tube 4 n'agglutinait ni ne lysait les GRM et elle n'inhibait pas l'agglutination des GRM par l'antisérum anti-GRM total -pour rappel, revoir les diapo suivantes Hémagglurination: il faut Ac divalent +Ag divalent + zone d’équivalence Hémolyse: il faut les deux Fc de deux Ac fixés à proximité l’un de l’autre sur l’Ag (pour les IgG; une IgM suffit pour fixer le complément…)

25 Activation de la voie classique du complément
Rappel du cours concernant l’Hémolyse Activation de la voie classique du complément -L’Ac se fixe sur le pathogène 1er composant du -Modification structurale de la partie Fc complément -Fixation du 1er élément d’un réseau complexe de protéines sériques (“le complément”) -Activation de la cascade protéolytique des différents composants du complément Pathogène quelconque Pore -Formation d’un pore et lyse du pathogène

26 Rappel du cours concernant l’Hémagglutination
*Réaction d’Hémagglutination

27 Hémagglutination (réseau)
Ac Hématies (GR) pur 1/2 Hémagglutination (réseau) 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Si rajoute du complément, il y a lyse même si l'hémagglutination n'est pas visible. Témoin (GR sans sérum)

28 -Exercice 7-Les réponses
En vous appuyant sur les résultats des tests décrits ci-dessous, indiquer quelle préparation était contenue dans chaque tube et expliquer pourquoi vous identifiez ainsi les contenus. La préparation du tube 1 agglutinait les GRM (L’ac de la préparation 1 est donc divalent), mais ne les lysait pas en présence du complément (pas de partie Fc). C’est donc le F(ab)’2 b. La préparation du tube 2 n'agglutinait pas les GRM (donc pas divalent), ni ne les lysait en présence du complément (donc pas de Fc). Cependant, lorsque cette préparation était ajoutée à des GRM avant l'addition de l'anti-GRM total, elle prévenait l'agglutination des cellules par l'antisérum anti-GRM total. Cela signifie que le fragment de la préparation 2 se fixe à l’Ag et empêche l’interaction et donc l’agglutination postérieure des Ag GRM avec l’Ac anti GRM. Il s’agit du Fab c. La préparation du tube 3 agglutinait les SRBC (divalent) et lysait aussi ces cellules en présence du complément (présence du Fc). C’est donc l’IgG d. La préparation du tube 4 n'agglutinait (pas divalent) ni ne lysait les GRM (pas de Fc) et elle n'inhibait pas l'agglutination des GRM par l'antisérum anti-GRM total (ne se fixe pas à l’Ag) c’est donc le Fc.