Rappel du cours sur la structure des Ac:

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1 Rappel du cours sur la structure des Ac:
-Exercice 14- On immunise une souris avec des IgA de bovin, et on teste le sérum ainsi obtenu par western-blot dans lequel on a séparé dans des conditions réductrices dénaturantes (gel A) ou non réductrices non dénaturantes (gel B) des IgA, des IgM et des IgG de bovin. Les résultats sont présentés plus loin. a) En vous référant à la structure des immunoglobulines, interpréter ces résultats. Rappel du cours sur la structure des Ac: L’IgG est monomérique L’IgM sérique est pentamérique IgA sécrétoire dimèrique (n=2) L’IgA sécrétoire est souvent dimérique

2 -Acmx anti-composant sécrétoire
Tout d’abord après avoir immunisé une souris, avec des IgA de bovin, on obtient un sérum polyclonal de souris contenant les Ac suivant: Au minima ces 2 types d’Ac, si on a injecté un monomère d’IgA H2L2 à la souris IgA de bovin Immunisation -Acmx anti-Ha Sérum polyclonal -Acmx anti-Lk ou l -Acmx anti-chaîne J -Acmx anti-composant sécrétoire Si on a injecté un dimère d’IgA (H2L2)2 à la souris, on aura alors les deux premiers types d’Ac plus ces deux là !

3 On a séparé sur gel dans des conditions différentes des IgA, des IgM et des IgG bovine.
IgA dimérique IgM pentamérique Si on décidait de colorer à l’aide du bleu de Coomassie les différentes protéines dans le gel A (en conditions dénaturantes et réductrices c’est-à-dire dissociant les différentes chaînes), on verrait les bandes suivantes pour chacune des classes d’Ig IgA 4 bandes IgM 3 bandes IgG : 2 bandes Ha Hm Hg L L L 1 pour la chaîne Hm à 50 kDa 1 pour la chaîne L à 25 kDa 1 pour la chaîne J (taille ?) 1 pour la chaîne Hg à 50 kDa 1 pour la chaîne L à 25 kDa 1 pour la chaîne Ha à 50 kDa 1 pour la chaîne L à 25 kDa 1 pour la chaîne J (taille ?) 1 pour la composante sécrétoire (taille ?)

4 Interprétation 1-Tout d’abord pour le gel A, concernant la piste 1 (IgA): on observe 4 bandes, cela qui signifie que, d’une part l’Ag utilisé pour l’immunisation contenait au moins l’IgA dimérique pour que le sérum immun contiennent les 4 types d’Ac différents nécessaires à la révélation de ces 4 bandes (cela peut aussi être un mélange monomère + dimère d’IgA), et d’autre part que l’IgA que l’on a fait migrée dans ce puits est également soit le dimère soit un mélange monomère + dimère d’IgA. A 50kDa c’est la chaîne lourde Ha qui est révélée par les Acmx anti-Ha du sérum de souris; à 25kDa les chaînes L k ou l sont révélées par les Acmx anti-L k ou l du sérum (on le sait car on doit connaître leur taille par cœur); enfin on a 2 bandes: à 14kDa c’est forcément la chaîne J car commune avec la piste 2 qui contient l’IgM (or la chaîne J est présente dans la structure des IgA mais aussi dans celle des IgM). Et la bande à 10kDa est donc forcément la composante sécrétoire. 2-Dans la piste 2 (IgM), on a normalement trois protéines différentes: Hm, L et J. Seules les chaînes L k ou l et la chaîne J sont révélées respectivement par les Acmx anti-Lk ou l et les Acmx anti-chaîne J du sérum. Les chaînes L et J ne présentent pas de différence d’une classe à l’autre. Elles sont identiques. La chaîne Hm est présente mais n’est pas révélée par le sérum car il ne contient pas d’Acm anti-Hm. Les chaînes lourdes sont très différentes d’une classe à l’autre et les Ac produits contre une chaîne lourde d’isotype donné (ici a) ne donnent pas de réaction croisée avec une autre isotype de chaîne lourde (m dans cette piste 2 et g dans la piste 3). Pas de composante sécrétoire pour l’IgM donc pas de protéine dans cette piste à 10kDa. 3-Dans la piste 3 (IgG), même chose : Hg et L sont présentes, seules les chaînes légères sont révélées par les Acmx anti-Lk ou l du sérum et pas de chaîne J ou composant S dans cette piste (les IgG sont monomériques!). Ha L J S Migration des différentes Ig bovines, transfert sur membrane de nitrocellulose puis révélation avec un sérum polyclonal murin (de souris) anti-IgA bovine contenant : -des Acmx anti-Ha -des Acmx anti-Lk ou l -des Acmx anti-chaîne J -des Acmx anti-composant sécrétoire

5 Interprétation pentamère dimère monomère
Sérum immun murin utilisé pour la révélation -Acmx anti-Ha -Acmx anti-Lk ou l -Acmx anti-chaîne J -Acmx anti-composant sécrétoire 1-Concernant le gel B, dans la piste 1 (IgA): on observe 2 bandes, une à 150kDa ce qui correspond au PM d’une Ig monomérique (PM [H2L2]=2x(50) + 2X(25)= 150 kDa) _ il s’agit du monomère d’IgA _ et une à environ 300 kDa (324 kDa en fait) qui correspond au PM de l’IgA dimérique: il s’agit bien donc d’un mélange monomère + dimère d’IgA que l’on a fait migré dans ce puits. Le dimère est révélé par les 4 types d’Acmx présents dans le sérum immun (Acmx anti-Ha, Acmx anti-L k ou l, Acmx anti-chaîne J et Acmx anti-composant S) et le monomère composé uniquement de chaînes lourdes Ha et de chaînes L est révélé par les Acmx anti-Ha et Acmx anti-L k ou l du sérum. 2-Dans la piste 2 (IgM), on observe une seule bande pour des protéines qui ont un PM bien supérieur à 300 kDa (pas d’indication précise, car les marqueurs de PM (échelle de protéines ou « protein ladder ») ne présentent pas de protéines au-delà de 300kDa), mais on peut supposer qu’il s’agit du pentamère car l’IgM n’existe que sous deux formes : la forme monomérique qui est membranaire uniquement (il s’agit du BCR à la surface des Lymphocyte B) et la forme sérique pentamérique. Le PM théorique d’une IgM est 5 x (150kDa) + 14kDa (chaîne J) = 764 kDa. Le pentamère est constituée de chaîne Hm non reconnues par le sérum immun comme on l’a indiqué précédemment (car ce sérum est dirigé contre un autre isotype qui est a), de chaînes L et d’une chaîne J. Le pentamère est donc reconnu par les deux types d’Acmx suivants présents dans le sérum: les Acmx anti-Lk ou l et les Acmx anti-chaîne J, communes aux IgA et aux IgM.

6 b) Des anticorps monoclonaux anti-IgA de bovin ont été sélectionnés par ELISA. Parmi ces anticorps monoclonaux deux ne reconnaissent aucune bande en western blot en conditions réductrices (i.e. traitement au bmercaptoEtOH qui réduit les ponts disulfures) en absence de sodium dodécyl sulfate (SDS). Expliquez ce résultat. Cela signifie que ces Acmx reconnaissent un épitope conformationnel et plus précisément que la structure conformationnelle reconnue par ces Acmx est constituée par la formation d’un pont disulfure car en conditions réductrices, les Acmx ne révèlent plus l’Ag ce qui signifie que leur épitope spécifique a été détruit par le traitement au bmercaptoEtOH. Cf diapo suivante pour rappel épitopes conformationnels versus linéaires … c) Un des Ac monoclonaux sélectionnés en ELISA reconnaît la bande de 14 kDa (c’est-à-dire comme on l’a vu question (a) il s’agit de la chaîne J) en western-blot (quand on ne le précise pas, on considère que c’est en conditions dénaturantes (SDS) et réductrices (bmercaptoEtOH)) mais ne donne aucune réaction d'immunoprécipiation en Mancini (technique qui, on le rappelle ici, nécessite la divalence de l’Ac, la divalence (au minimum) de l’Ag par rapport aux Ac présents dans la réaction et d’être dans la zone d’équivalence). Expliquer ce résultat. Cela signifie que l’épitope reconnu par cet Acm est linéaire (il n’est pas altéré par le traitement SDS-bmercaptoEtOH, puisque l’Ac le reconnaît même après déroulement de la protéine et réduction des ponts disulfures) et il est représenté de manière unique à la surface de la protéine J (autrement dit l’Ag est monovalent) puisqu’il est reconnu en ELISA mais ne peut pas être immunoprécipité par la technique de Mancini dans laquelle l’épitope doit être au moins présent 2 fois à la surface de l’Ag pour pouvoir créer un réseau en présence de l’Acm spécifique.

7 Epitopes linéaires versus épitopes conformationnels
VH VL CL CH1 CH2 CH3 Protéine native non dénaturée Epitopes conformationnels VH VL CL CH1 CH2 CH3 Protéine dénaturée VH VL CL CH1 CH2 CH3 Ici, après dénaturation de la protéine, on a perdu les épitopes conformationnels (rouge et jaune) tandis que les épitopes linéaires (en bleu) sont conservés et donc reconnus chacun par leur Ac spécifique.