Correction du feuillet de TD exo-1-2

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1 Correction du feuillet de TD exo-1-2
exercice 1 (cours): Donner les caractéristiques d’une réponse immunitaire primaire et d’une réponse immunitaire secondaire Primaire / secondaire = Réponse immunitaire ADAPTATIVE SPECIFIQUE. Ne pas confondre avec Réponse innée et réponse spécifique !!!

2 Principe de la vaccination
Sélection clonale visualisée lors de l’immunisation Injection Ag A Souris Prélèvement quotidien de sang Dosage des Ac Anti-AgA dans le sérum (technique ELISA) Antigène A Réponse secoondaire : Suite à la Réinjection de l’Ag (4 à 5j) B mémoires *Temps de latence court, réponse rapide de 1 à 2j (= LB mémoire) IgG *Production Ac très forte (100 à 1000x), IgG Commutation isotypique (switch) + Hyper Mutations Somatiques B naïfs IgM *Durée très longue Principe de la vaccination *Temps de latence = sélection clonale (fixation Ag sur clone, prolifération et différenciation en plasmocytes et LB mémoires) *Réponse primaire : production Ac faible (IgM) avec max au 16eJ ; plateau puis décroissance

3 La réponse immunitaire secondaire est donc -plus rapide (phase de latence plus courte due à la stimulation de B mémoires déjà présentes) -plus intense (production plus importante d’Ig par les Bm par rapport aux B naïfs) -plus persistente (plateau qui décroît lentement) -plus efficace (IgG plus affine que IgM, IgG peuvent remplir de nombreuses autres fonctions que l’IgM) comparée à la réponse immunitaire primaire.

4 Un étudiant croit avoir identifié une nouvelle
exercice 2 (cours / TD): Un étudiant croit avoir identifié une nouvelle classe d’immunoglobuline a) donner les caractéristiques d’une Ig Faire un rappel de la structure H2L2 ainsi que les différentes classes. Il faut ensuite la dessiner avec les détails montrant ponts disulfure et domaines immunoglobuliniques, les noms des domaines et l’orientation des chaînes !!! Se baser pour le schéma sur le monomère IgG mais vous pouvez indiquer qu’il existe d’autres classes pour lesquelles présence de ponts disulfure en plus ou en moins, région CH4 en plus ou régions charnières qui peuvent être différentes (cf structures des autres classes dans le cours mais pas besoin de retenir tout, notamment nombre de ponts disulfures,…) On peut aussi donner le résultat du traitement par bmercaptoEtOH et des enzymes papaïne et pepsine

5 Une immunoglobuline = un anticorps
Sa structure : H2L2 2 chaînes lourdes H pour heavy 2 chaînes légères L pour light H2L2 = 2 x H (50k Da) + 2 x L(25kDa) = 150kDa 2 types de chaîne L ( et ) et 5 isotypes de chaînes H () définissant les différentes classes d’Ig (IgM, IgE, IgD, IgG, IgA) Une Ig est constituée de domaines immunoglobuliniques (séquence d’AA se repliant de manière caractéristique avec présence d’un pont diS intrachaîne) Boucle de 60 aa s s 110 aa organisés en feuillets 

6 Site de fixation à l’Ag N ter N ter N ter N ter VH VH VL VL CH1
Schéma détaillée d’une Ig (ou Ac soluble) montrant ponts disulfure et domaines immunoglobuliniques, les noms des domaines et l’orientation des chaînes !!! Ici IgG N ter N ter N ter N ter VH VH Site de fixation à l’Ag VL VL CH1 = 6 régions HV/site C’est à dire 3 HV pour VH 3 HV pour VL CH1 CL CL C ter C ter CH2 CH2 CH3 CH3 C ter C ter HV2 HV2 HV1 HV1 HV3 HV3 VL CL Chaîne L VH CH1 CH2 CH3 Chaîne H Régions HV= Hyper Variables ou régions CDR (Complementary determining region) : 5 à 6 aa.

7 2b) Vous préparez des antisérums de lapin contre l'IgG humaine totale, la chaîne k humaine et la chaîne g humaine. Décrire la procédure expérimentale. Puis, en admettant que ce soit réellement une nouvelle classe d'Ig avec lesquels de ces antisérums se lierait-elle ? Justifier votre réponse. procédure expérimentale = une Immunisation On va immuniser un lapin avec chaque Ag suivant : l'IgG humaine totale, la chaîne k humaine et la chaîne g humaine Lapin 1 avec Ag1= l'IgG humaine totale Lapin 2 avec Ag2= la chaîne k humaine Lapin 3 avec Ag3= la chaîne g humaine .

8 On décrit l’immunisation une fois pour toutes: première injection de l’Ag en présence de l’adjuvant complet de freund ACF (huile minérale + débris de Mycobacterium Tuberculosis), puis après un mois, deuxième ,troisième, quatrième injections avec l’Ag + adjuvant incomplet de freund AIF (huile minérale seule) à intervalles de 15j. On vérifie que l’immunisation a marché grâce à un ELISA dans lequel l’Ag fixé au fond du puits est l’Ag qui a permis l’immunisation (la fixation peut se faire avec des protéines solubles « natives » par la formation de liaisons hydrophobes entre la protéine et le plastique de la plaque ELISA), on sature « les sites non spécifiques » (c’est à dire non occupés par l’Ag) de fixation du plastique grâce à une solution de saturation (généralement solution de BSA ou de gélatine) puis on lave au PBS-Tween (le tween est un détergent) puis on incube avec l’Ac primaire= le sérum de lapin immun (on pense à faire un puits qui sert de contrôle négatif en présence de sérum pré-immun qu’il faut prélever avant la première injection de l’Ag) on lave puis on incube avec l’Ac secondaire qui est un sérum polyclonal de chèvre anti-IgG de lapin couplé à la HRP (Horse Radish Peroxydase). Ici on a décrit un ELISA indirect (cf direct, sandwitch ou compétitif dans le diaporama du cours). On révéle avec le substrat de la perox qui est H2O2 et un chromogène incolore. Les ions superoxydes ainsi libérés à partir du H2O2 métabolisé par la perox oxydent le chromogène qui devient coloré et on mesure la DO avec un spectrophotomètre. L’intensité de la DO est proportionnelle à la présence d’Ac2 fixé sur Ac1 lui-même fixé sur l’Ag.

9 Le Sérum polyclonal du Lapin 1 immunisé avec l’Ag1 ( IgG humaine totale) contient
- des anticorps monoclonaux anti-chaîne lourde Hg - des anticorps monoclonaux anti-chaîne légère Ll - des anticorps monoclonaux anti-chaîne légère Lk Le Sérum polyclonal du Lapin 2 immunisé avec l’Ag2 (la chaîne k humaine) contient - des anticorps monoclonaux anti-chaîne légère Lk Le Sérum polyclonal du Lapin 3 immunisé avec l’Ag3 (la chaîne g humaine) contient

10 Si la protéine est un nouvel isotype d'immunoglobuline, que l’on appelera « IgN » elle se liera en ELISA (à décrire rapidement, voir plus loin !!!) aux anti-sérum suivants: -à l’antisérum contre IgG humaine totale. En effet, la présence des Ac anti-Ll et Ac anti-Lk permet la réaction de cet anti-sérum avec l’IgN car on sait que les chaînes légères (l et k) sont communes à toutes les classes (ou autrement dit elles sont identiques d’une classe à l’autre) et sont donc présentes et reconnues dans l’Ig de nouvel isotype. -L’IgN se liera donc également à l’antisérum dirigé contre chaîne Lk humaine qui contient l’Ac anti-Lk

11 Par contre si la protéine est un nouvel isotype d'immunoglobuline, elle ne se liera pas à
-l’antisérum dirigé contre la chaîne lourde Hg humaine qui contient des Ac anti-Hg incapables de reconnaître un autre isotype de chaîne lourde que g. En effet, l’isotype de la chaîne lourde est spécifique de la classe d’Ig !

12 Il est bienvenu de décrire ici L’ ELISA indirect correspondant à ce test en particulier ie test de chaque antisérum contre l’IgN H2O2 + chromogène incolore Sérum polyclonal de chèvre c’est-à-dire des IgG de chèvre anti-IgG de lapin couplés avec la HRP HRP chromogène coloré H2O + ions superoxydes Sérum polyclonal issu lapins 1, 2 ou 3 Ag=IgN

13 2c) procédé expérimental pour la préparation d’un antisérum spécifique de l’IgN donc de son isotype : Il faut isoler la chaîne lourde de l’IgN qui spécifie l’isotype de la nouvelle classe ou un fragment de cette Ig qui ne contient que de la chaîne lourde et surtout pas de fragment contenant la chaîne légère commune à toutes les classes. Cf éléments rappel de cours diapo suivante.

14 Rappels de quelques propriétés utiles pour séparer les différents fragments ou chaînes d’une Ig
Nter Nter 1 F(ab’)2 + Fc dégradé Cter Structure polymérique : ponts diS interchaînes  région charnière Cter papaïne Ponts diS : sensibilité aux protéolyses ménagées par la papaïne et la pepsine (Réduction des ponts diS) Séparation des chaînes H et L Fab = fragment antigen binding Fc= fragment cristallisable 2 Fab + 1 Fc Fab et F(ab’)2 fixent Ag H2L2 = 2 x H (50k Da) + 2 x L(25kDa) = 150kDa

15 On sépare chaîne lourde et chaîne légère avec le beta-mercaptoéthanol
On traite avec la papaïne pour avoir des Fab et des Fc ou On sépare les fragments par électrophorèse sur gel de polyacrylamide: on récupère (on la découpe) la bande la plus haute dans chacun des cas ci-dessus (chaîne lourde ou Fc qui ne contient que des chaînes lourdes donc spécifique du nouvel isotype) Electroélution de la protéine de chaîne lourde ou de la partie de Hg présente dans le Fc. On place la bande de gel découpée en petits morceaux (après prétraitement et chauffage pour faciliter sa migration hors du gel) dans la cuve côté anode et les protéines vont migrer hors du gel vers le fond de la cuve proche de la cathode.

16 Renaturation par dialyse de cette protéine (elle vise à replier la protéine dans sa conformation d’origine en chassant les produits qui empêchent son repliement dont SDS, bmercaptoEtOH…) Ainsi on espère générer des Ac contre les épitopes conformationnels de cette protéine, et s’assurer que suite à une immunisation utilisant cette protéine ainsi renaturée, les Ac obtenus marcheront contre la protéine native aussi !) Puis Immunisation de l’animal et vérification que l’immunisation a marché par ELISA en présence de la chaine lourde seule comme Ag et sérum de l’animal en tant qu’Ac primaire (+sérum non immun = contrôle négatif!) puis ac secondaire etc… ne pas oublier étapes de saturation, lavages et révélation