Exploration hémostase primaire – actualités 2007

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1 Exploration hémostase primaire – actualités 2007
Pr Thomas Lecompte, Service d’Hématologie Biologique, CHU Nancy

2 Exploration de l’hémostase primaire en 2007 : moyens de base
numération plaquettaire hématocrite TC+A / VIII-Willebrand thrombopénies + morphologie anémies anomalies du f v W

3 Exploration de l’hémostase primaire en 2007 : facteur von Willebrand
Triade classique : TS  Num. plaq. Normale TC+A  (F.VIII )

4 Exploration de l’hémostase primaire en 2007 : facteur von Willebrand
Triade classique : TS  Num. plaq. Normale TC+A  (F.VIII ) f v W - antigène cofacteur ristocétine liaison au collagène etc.

5 Exploration de l’hémostase primaire en 2007 : facteur von Willebrand
Triade classique : TS  Num. plaq. Normale TC+A  (F.VIII ) f v W - antigène cofacteur ristocétine liaison au collagène etc. pièges : Thrombopénie Antigène normal F.VIII  isolément

6 Exploration de l’hémostase primaire en 2007 : moyens
 Numération plaquettaire Facteur von Willebrand Tests globaux : - Temps de Saignement TS - dispositifs in vitro (type PFA-100) Fonctions plaquettaires in vitro

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8 Exploration de l’hémostase primaire en 2005 : moyens de base / 2
Temps de Saignement test global in vivo

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13 PFA 100 (Platelet Function Analyzer)
test in vitro Mesure du temps d’occlusion Principe : évaluation de la capacité d’activation des plaquettes en sang total en condition de flux avec contraintes de cisaillement élevées

14 UTILITE CLINIQUE PFA-100 ? TL fév 2003
question clairement posée compréhension des phénomènes intervenant dans l’évolution clinique et de ceux mis en jeu dans le test qualités métrologiques bonnes, conditions de réalisation du test établies (notamment aspects préanalytiques) performances diagnostiques …

15 PFA 100 (Platelet Function Analyzer)
Dépendant de la NP et de l’hématocrite Sensible aux interactions avec le facteur von Willebrand :  GPIb/FvW  GPIIb/IIIa / FvW-collagène

16 PFA 100 (Platelet Function Analyzer)
Dépendant de la NP et de l’hématocrite Sensible aux interactions avec le facteur von Willebrand :  GPIb/FvW  GPIIb/IIIa / FvW-collagène Détecte les atteintes de la voie du thromboxane Peu sensible à celles de la voie de l’ADP

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18 Fonctions plaquettaires in vitro :
 Tests d ’agrégation  Cytométrie en flux

19 Test d ’agrégation plaquettaire
Les plaquettes, en quantité suffisante, sont capables d’agréger après stimulation par différents agonistes. Détection (le + souvent) par méthode photométrique : éclaircissement du milieu dû aux agrégats plaquettaires % agrégation PRP + agoniste PRP PPP 100 37°C 37°C temps

20 Cazenave, EFS Alsace, Inserm U311

21 Test d ’agrégation plaquettaire
Les plaquettes, en quantité suffisante, sont capables d’agréger après stimulation par différents agonistes. Détection (le + souvent) par méthode photométrique : éclaircissement du milieu dû aux agrégats plaquettaires Agrégamètres SODEREL MEDICAL, France

22 Influence du pré-analytique +++
Préparation des plaquettes Qualité du prélèvement Proportion citrate/plasma Traumatismes liés au pipetage et centrifugation Contamination par GR et GB Conservation Température (ambiante) Interface air/liq (bulles) pH-CO2 (alcalinisation du plasma) Déroulement des tests NP ( G/L) Propreté des cuves Température (37°C) Agitation Homogénéisation plaquettes/agoniste Délai < 3h après prélèvement

23 Test d’agrégation plaquettaire
Agonistes en 1ère intention : -  max de transmission lumineuse Temps de latence (collagène) Paramètres étudiés : - Allure de la courbe : vagues, réversibilité

24 Réponse au collagène Réponse avec temps de latence : 30 à 60s
Mécanisme : Adhésion de qq plaquettes aux fibres de collagène Sécrétion ADP (grains δ) et synthèse TXA2 Activation des autres plaquettes A forte Cion, AP indépendante du TXA2 (mobilisation Ca2+i)  intérêt de tester 2 concentrations (faible et forte) Explore : - Possibilité d’adhérence au collagène (GPIb/IX/V) - Perturbation des système d’amplification (TXA2, sécrétion)

25 Réponse à l’acide arachidonique
AA métabolisé par la voie des COX pour former le TXA2 TXA2 inhibe l’adénylate synthase plaquettaire : ↓ AMPc et ↑ Ca2+i Activation plaquettaire Explore : - Voie d’amplification liée au TxA2 - Réponse aux inhibiteurs des COX (aspirine et AINS)

26 Récapitulatif

27 ≠ activateur plaquettaire
Ristocétine ≠ activateur plaquettaire Permet la fixation du vWF plasmatique avec GPIb plaquettaire => AGGLUTINATION ,

28 Effet de l ’aspirine sur l’agrégation plaquettaire
Profil normal Répercussions Effet principal Profil aspirine (appareils Soderel)

29 Exemple de thrombopathie : Thrombasthénie de Glanzmann

30 Autres tests permettant d’évaluer la fonctionnalité plaquettaire
Tests plus spécifiques permettant une exploration « ciblée » Tests de sécrétion : - sécrétion ATP : test luciférine/luciférase - CMF : test à la mépacrine  Expression des Gp plaquettaires (CMF)

31 Cytométrie en Flux

32 Plaquette au repos GP IIb/IIIa GP Ib/IX/V Will Will collagène
Grains denses Granules a (P-sélectine) Will Will collagène

33 Exploration des granules alpha plaquettaires par CMF
Trousse Platelet Gp Biocytex – Diagnostica Stago Patient Valeurs de références Etat basal Activation TRAP GPIIbIIIa CD41a 53,5 85,0 37-65 58-112 GPIb CD42b 42,7 25,3 27-49 9-29 Résultats exprimés en nb de sites occupés par l’anticorps x103/plaquette Absence d’anomalie d’expression à l’état basal Bonne réactivité plaquettaire après stimulation par le TRAP

34 Activation plaquettaire
Plaquette au repos Plaquette activée GP IIb/IIIa GP IIb/IIIa activation GP Ib/IX/V GP Ib/IX/V Grains denses Granules a (P-sélectine) Will Will collagène

35 Exploration des granules alpha plaquettaires par CMF
Trousse Platelet Gp Biocytex – Diagnostica Stago Patient Valeurs de références Etat basal Activation TRAP GPIIbIIIa CD41a 53,5 85,0 37-65 58-112 GPIb CD42b 42,7 25,3 27-49 9-29 GMP140 CD62P 0,8 11,8 <1 >1 Résultats exprimés en nb de sites occupés par l’anticorps x103/plaquette Absence d’anomalie d’expression à l’état basal Bonne réactivité plaquettaire après stimulation par le TRAP

36 Exploration des granules denses plaquettaires par CMF
Test à la mépacrine par CMF : Prélèvement : sang veineux recueilli en présence de citrate. Réalisation d’un PRP. Principe la mépacrine, dérivé de la quinacrine, capturé de façon sélective par les grains denses et non par les grains  et émets une fluorescence verte après excitation à 488 nm. Phase de capture : incubation des plaquettes au repos en présence de mépacrine. Les plaquettes internalisent la mépacrine dans les grains denses, rendant les plaquettes fluorescentes. Phase de sécrétion : les plaquettes activées par la thrombine, relarguent la mépacrine dans le milieu extra-cellulaire ce qui entraîne une diminution de leur fluorescence.

37 Exploration des granules denses plaquettaires par CMF
Étude de la capture/sécrétion de mépacrine par cytométrie en flux (Wall JE, 1995) Capture de mépacrine Sécrétion de mépacrine (stimulation plaquettaire : thrombine 0,4 UI/mL) x3,60 /2,21 Diminution de la capture et de la sécrétion de mépacrine par les plaquettes

38 Exploration des granules denses plaquettaires par CMF
Mesure de l’expression de CD63 par CMF : Principe: le CD63 est un marqueur de la membrane des granules denses Analyse à l’état basal : mesure de la fluorescence des plaquettes après immunomarquage par un Ac anti-CD63-FITC. Analyse après stimulation plaquettaire par la thrombine : les plaquettes activées par la thrombine sécrètent leur granule  dont leur membrane vient s’accoler à la membrane plasmique, ce qui entraîne une augmentation de l’expression de CD63, soit une augmentation de la fluorescence liée à l’immunomarquage anti-CD63-FITC.

39 Étude de l’expression membranaire de CD63 par cytométrie en flux
(stimulation plaquettaire : thrombine 0,4 UI/mL) X1,99 Diminution de l’expression de CD63 après stimulation plaquettaire

40 Exploration de la signalisation voie ADP par CMF

41 Anomalie de réponse à l’ADP ?
(appareils Soderel)

42 Réponse à l’ADP P2Y12

43 Platelet VASP-FCM Biocytex
ADP - P2Y12 + PGE1 AC + AMPc + PKA Connection avec schéma précédent ? Je ne sais pas s ’il est démontré que VASP régule IIb/IIIa… qui a adapté ??? VASP-P Plaquette non activée VASP PP Adapté d’après Horstrup et al. Eur J Biochem 1994, 225 : 21-7

44 Autres tests permettant d’évaluer la fonctionnalité plaquettaire
Nouveaux tests permettant d’évaluer la réponse aux traitements antiplaquettaires Appareils de biologie délocalisée (VerifyNow) Test VASP

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47 Appareil VerifyNow

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49 EN CONCLUSION… 2007 question clairement posée (clinique) TS : de moins en moins utilisé Num plaq + morphologie vWF thrombopathies majeures -SPD coag : W Noramandie /activités procoagulantes plaquettaires thrombopénies constitutionnelles

50 Exploration hémostase primaire
Véronique Latger-Cannard Marie Toussaint-Hacquard Service d’Hématologie Biologique, CHU Nancy