Module 6.2 L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA.

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1 Module 6.2 L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

2 Justification des analyses d’OTA
Soutien des programmes de surveillance: Production de données sur le degré et la répartition de la contamination, Mesure de l’impact des mesures préventives et optimisation des programmes; Certification que la teneur d’OTA est conforme aux spécifications officielles ou à celles des acheteurs, Contribution à la recherche visant à améliorer les connaissances et à tester des solutions. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

3 Planification des analyses d’OTA
Pour bien exploiter les résultats des analyses d’OTA, il est indispensable que les services d’analyse aient: Les compétences et le matériel nécessaires pour effectuer les analyses aux niveaux de sensibilité et de quantification requis, La capacité de procéder au nombre d’analyses requis dans les délais fixés. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

4 Investissements nécessaires à l’analyse d’OTA
Locaux adaptés: Réduction des risques professionnels; environnement permettant d’assurer le bon fonctionnement et l’entretien du matériel; Equipements et matériels nécessaires: Pour mettre en oeuvre le dépistage et les méthodes d’analyse officielles, suivant le besoin; Personnel compétent et qualifié: Analystes ayant un niveau de deuxième cycle universitaire ou titulaires d’un diplôme d’études supérieures; techniciens qualifiés pour assurer l’entretien et la réparation du matériel; personnel de soutien; formation périodique en cours d’emploi. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

5 Les coûts sont-ils acceptables?
Renforcement de la confiance dans le secteur national du café: Lorsque l’on peut clairement démontrer la qualité des programmes officiels de surveillance et d’analyse d’OTA, la confiance des importateurs et la place du pays dans le commerce international s’en trouvent renforcées. Protection des consommateurs nationaux: Contre le risque que le café de qualité inférieure ne soit destiné aux consommateurs locaux. Recouvrement des coûts par l’industrie: Un recouvrement au moins partiel des coûts est envisageable. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

6 Questions techniques relatives aux programmes d’analyse d’OTA
Les principaux volets des programmes d’analyse d’OTA sont: Les plans d’échantillonnage, Les méthodes d’analyse validées, Le système d’assurance de la qualité. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

7 Plans d’échantillonnage de l’OTA dans le café
La distribution hétérogène d’OTA dans les lots de café justifie qu’une attention particulière soit portée à l’échantillonnage car il est important d’obtenir des échantillons représentatifs. Les plans d’échantillonnage doivent être conçus par rapport à l’objectif visé: Obtenir une unité représentative pour estimer l’‘ensemble’, Caractériser un segment spécifié de la population. L’élaboration de plans d’échantillonnage officiels a pour but de fournir des méthodes internationales afin de prévenir les litiges commerciaux d’ordre juridique et technique liés à l’échantillonnage (Codex Alimentarius). Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

8 Détermination des méthodes d’échantillonnage
Les méthodes d’échantillonnage utilisées dans le cadre des programmes de surveillance et d’analyse d’OTA doivent préciser: Les procédures de prélèvement et de préparation des échantillons, La taille et le nombre de prélèvements élémentaires pour un échantillon représentatif, Les critères statistiques d’acceptation ou de refus d’un lot sur la base des échantillons prélevés. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

9 Aspects-clés de l’échantillonnage destiné aux analyses officielles d’OTA
La taille de l’échantillon et le nombre d’échantillons influent sur: Le pourcentage de lots acceptés sur la base de concentrations inférieures à la limite réglementaire (bons lots), Le pourcentage de lots refusés sur la base de concentrations supérieures à la limite réglementaire (mauvais lots). Incertitudes liées à la méthode de vérification de l’OTA Risques pour l’acheteur Risques pour le vendeur Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

10 Conditions requises pour les méthodes officielles d’analyse
Les méthodes doivent être validées, Exactes, Et les résultats doivent être reproductibles (intra et interlaboratoires) Dans les limites des critères de performance minimum établis. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

11 Principales caractéristiques des méthodes d’analyse officielles
Exactitude, Applicabilité, Limites de détection/détermination, Linéarité, Précision, Répétabilité Sélectivité, Réactivité. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

12 Qui décide des méthodes d’analyse officielles?
Les méthodes validées peuvent être reconnues comme méthodes officielles par: Le Codex Alimentarius, AOAC International, Les normes nationales et internationales. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

13 Choix de méthodes en cas de non disponibilité ou de non applicabilité de méthodes officielles
Validation interne – sur la base du document de l’Union internationale de chimie pure et appliquée (IUPAC) intitulé ‘Harmonized Guidelines for Single Laboratory Validation of Methods of Analysis’. Méthode précisée dans la norme ISO/IEC 17025:1999 ou dans les Principes de bonnes pratiques de laboratoire. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

14 Méthodes officielles Méthodes validées au niveau international ou par collaboration dans le cadre des Protocoles internationaux harmonisés Café torréfié - Entwisle et coll. 2001; AOAC ; CEN EN 14132:2003.  Café vert - Vargas et al. 2005; AOAC Le site web de l’AOAC ne recommande aucune méthode de dépistage officielle pour l’ochratoxine A dans le café. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

15 Diagramme des étapes d’analyse d’OTA
Diagramme des étapes générales d’échantillonnage, de préparation des échantillons et d’analyse des mycotoxines dans les denrées agricoles Lot ECHANTILLONNAGE Echantillon BROYAGE ET HOMOGENISATION Préparation de l’échantillon Assurance de qualité analytique (AAQ) Sous-échantillonnage Extraction Analyse de détermination de l’OTA Nettoyage Séparation et quantification Résultat de l’analyse des mycotoxines Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

16 Evaluation des méthodes d’analyse d’OTA
Critères opérationnels importants: Exactitude et répétabilité. Conditions de réalisation importantes: Rapidité de l’analyse, Analyse qualitative ou quantitative, Compétences requises pour opérer les dosages, Coûts initiaux et récurrents. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

17 Les étapes d’analyse de l’OTA: préparation de l’échantillon
Etape critique de l’analyse. Exige du temps: Broyage Homogénisation Préparation du mélange Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

18 Les étapes d’analyse de l’OTA - extraction
Des solvants spécifiques sont utilisés en fonction du substrat/ou des étapes de purification/quantification Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

19 Les étapes d’analyse de l’OTA - extraction
Retrouver la véritable concentration de la mycotoxine est un point critique Solvant organique en présence d’un acide ou solvant d’extraction contenant un bicarbonate de soude aqueux Agitateur secoueur ou mélangeur à grande vitesse Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

20 Les étapes d’analyse de l’OTA - nettoyage
Implique essentiellement: La séparation de la mycotoxine des autres substances extraites en même temps, L’étape de concentration initiale. Méthodes de nettoyage: Les procédures conventionnelles sont longues et laborieuses, Colonne d’immunoaffinité avec sorbants pour études immunologiques en phase solide: Un évolution importante, Fournit des méthodes hautement sélectives. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

21 Les étapes d’analyse de l’OTA - nettoyage
Nettoyage d’une colonne d’immunoaffinité contenant du café vert Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

22 Les étapes d’analyse de l’OTA - extraction, détection et quantification
Les méthodes disponibles sont: La chromatographie liquide avec détection par fluorescence, La chromatographie en couche mince, Le test ELISA (acronyme de ‘Enzyme-linked immunosorbent assay’), La fluométrie, Les instruments de lecture latérale (FLD), Le dosage immunologique par polarisation de fluorescence (FPIA). Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

23 Les étapes d’analyse de l’OTA: extraction, détection et quantification
Nouvelles méthodes analytiques Méthodes d’extraction rapide, peu onéreuses: Fondées sur des biosenseurs, Kits de diagnostic rapide sur bandelette. Chromatographie liquide couplée: Aux techniques d’onisation par électropulvérisation en spectométrie de masse (MS), Spectométrie de masse en tandem ou séquentielle (MS/MS). Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

24 Chromatographie liquide et analyse d’OTA
Principaux avantages: Possibilité d’automatisation, Pouvoir d’extraction, Sélectivité, Limites de détection plus faibles (0,12-0,2 g/kg). Principaux inconvénients: Coût élevé, Exige des analyses et des techniciens qualifiés. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

25 Chromatographie liquide et analyse d’OTA
Détection et quantification Chromatogramme d’une solution d’OTA standard à une concentration de 0, µg/mL. Phase inverse 250x4,6 mm – 0,5µm. Détection par fluorescence. Phase mobile: acétonitrile: méthanol: eau: acide acétique( ). Vitesse de filtration: 0,8mL/min. Processeur d’échantillons automatique Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

26 Chromatographie à couche mince (CCM) et analyse d’OTA
Technique simple, rapide, économique, robuste Principaux avantages Relativement bon marché Expérience et compétences considérables dans les pays en développement Utilisée dans les applications courantes Colonne d’immunoaffinité Prélèvements d’échantillons libres des principales interférences de substrats Adaptée à l’analyse l’analyse CCM unidimensionelle Amélioration: sensibilité, extraction, résolution et visualisation Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

27 Chromatographie à couche mince et analyse d’OTA
Confirmation d’OTA par CCM Pulvérisation de chlorure d’aluminium et de carbone de soude sur les plaques, Exposition des plaques à la vapeur d’ammoniaque, La chromatogaphie à couche mince en phase inversée est considérée comme une méthode de confirmation de la présence d’OTA dans le café. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

28 Chromatographie à couche mince et analyse d’OTA
Principaux inconvénients: Le coût élevé des fluorodensitomètres, La quantification reste un facteur contraignant, Les analystes doivent être capables de quantifier la toxine par examen visuel, Le manque de résolution, La sensibilité est médiocre. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

29 Chromatographie à couche mince et analyse d’OTA
Des échantillons d’OTA standards et naturellement contaminés sont dissolus par de l’acide acétique et du toluène (99:1, v/v) et observés sur des plaques CCM normales Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

30 Méthodes de détection pour l’analyse d’OTA
Principaux avantages: Méthodes d’essai rapides, Faciles à utiliser, Analyse réalisable sur le terrain. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

31 Méthodes de détection pour l’analyse d’OTA
Limites: Réponse qualitative: contamination oui/non, Faux résultats négatifs, Nécessité de confirmer les résultats positifs. Inconvénients: Coût récurrent élevé, Manque d’attention aux conditions de prélèvement des échantillons, Tendance à ignorer les conditions d’échantillonnage. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

32 Méthodes de détection pour l’analyse d’OTA
Kits de tests de détection du café Ochratoxin (2 – 40ppb) Analyse Société Nom du kit Reconnaissance Substrats primaires Ochratoxine r-Biopharm GmbH RIDASCREEN OTA Column - Grains de café VICAM OchraTest OTA TECNA S.r.l. Immunoscreen OCHRA Céréales, al.animale café vert, cacao, vin Tepnel BioSytems Ltd. BioKits OTA Assay Céréles, fruits secs, vin blanc OTA et B Romer Labs AgraQuant OTAssay (2 – 40ppb) Orge, maïs, café vert, maïs, soja et blé AgraQuantR ELISA Test Kit Maïs, orge, café vert, blé Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

33 Test ELISA pour l’analyse d’OTA
Test de détection populaire et utile en raison de la disponibilité des anticorps policlonaux et monoclonaux dirigés contre l’OTA. Avantages: Facilité d’utilisation, Nombre d’échantillons pouvant être analysés simultanément. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

34 Test ELISA pour l’analyse d’OTA
Inconvénients: Moins exact et moins sensible, Très peu de corrélations ont été montrées, Faux résultats positifs ou négatifs, À ne pas utiliser comme méthode quantitative, À n’utiliser que pour les denrées alimentaires pour lesquelles le procédé a été largement testé et validé, Procéder à des contrôles suffisants pour chaque test. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

35 Méthodes spectrofluométriques pour l’analyse d’OTA
Condition requise: Utilisation de colonnes d’immunoaffinité couplées à un fluoromètre. Principal inconvénient: Augmentation des taux de résutats faux positifs/faux négatifs. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA

36 Assurance de la qualité analytique
Les programmes d’assurance de la qualité analytique (AQA) sont indispensables pour valider les résultats. L’accréditation est importante lorsque l’acceptabilité est exigée au niveau international. Des directives détaillées concernant l’AQA pour l’analyse d’OTA sont fournies dans les documents de référence du module 5.2 du présent CD-Rom. Module 6.2 – L’analyse de l’OTA: une composante importante des programmes de prévention d’OTA