Le séquençage à grande échelle au Genoscope

Présentation au sujet: "Le séquençage à grande échelle au Genoscope"— Transcription de la présentation:

1 Le séquençage à grande échelle au Genoscope
Stratégies actuelles et perspectives P. Wincker, Séminaire INRA, Paris,

2 Status: Public Institute
Mission : provide high-throughput sequencing data to the French Academic community , and carry out in-house genomic projects Creation 1997 Part of the CEA Institut de Génomique since 05/2007

3 Procedures on Scientific Projects
in house : evaluated by the Scientific Committee collaborative: proposed by external labs (annual call for proposals) - evaluated by the Scientific Committee supported by Genoscope's budget shared cost: consumables and labor supported by applicant - other costs on Genoscope's budget approval by Scientific committee > reads paid services

4 Breakdown of sequencing activity since 1998
Total reads

5 Breakdown of sequencing activity in 2006 Total reads 12 138 976
Coûts partagés 1,4%

6 Successful applications since 1998
Total 188

7 Sequence categories

8 Genomes (finished and in progress)

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10 L’organisation du séquençage au Genoscope

11 Personnel (01/01/06) 11 7 43 9 5 26 3 6 16 140 2001 Mapping
3 6 16 140 2001 Mapping Libraries, subcloning Sequencing + template prepping Finishing Development Research projects R and D Robotics Informatics Bio-informatics QC and QA Infrastructure (Kitchen, building etc.) TOTAL (FTE) 8 11 18 15 4 27 3 21 24 2 9 150

12 Niveaux d’accès aux capacités du Genoscope par Appel d’Offres
Projet Séquençage Sanger, 454 (2007), Solexa (2008) Assemblage, finition, clustering Annotation procaryote (MAGE) Annotation eucaryote (GAZE)

13 Sélection des projets Appel d’offres évalué annuellement par un conseil scientifique externe ( ) A partir de 2008 : Appel d’offres (GIS Ibisa) Projets ANR (Programme Génomique)

14 Sequencing equipment total capacity
ABI (30 M bases/day) 454/GSFLX 1 (100 M bases/day)

15 Impact des nouvelles technologies de séquençage

16 Evaluation des NTSs au Genoscope
Qualité : des lectures et des assemblages Applications : fonction de la taille des génomes, complémentarité aux autres technologies Impact sur l’obtention d’une séquence «finie »

17 Exemple du séquenceur Roche / 454

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23 454 data (flowgram) Sanger data (chromatogram)

24 Evaluation de la qualité des lectures :
Mapping des lectures 454 sur la séquence finie d’Acinetobacter baylyi lectures mappées (soit 99,55%) nt alignés contenant erreurs (soit 1,48% d’erreurs) Avec Q ≥ 20, erreurs (8.10-3) et Q ≥ 40, erreurs (3.10-3) Sur les lectures mappées à 100%, sont sans erreurs (35%)

25 Position des erreurs dans les lectures 454

26 Position des erreurs par type dans les lectures 454

27 Evaluation des assemblages 454
Deux types d’assemblage proposés : De novo Dirigé (en utilisant la séquence d’un génome très proche)

28 Taille du N50 à différentes profondeurs (assemblage de novo)

29 Taille du N50 à différentes profondeurs (de novo vs dirigé)

30 Erreurs concentrées dans les régions homopolymériques
Fonction de la taille de l’homopolymère Pour M. agalactiae, couverture de 30x si (N)n avec n<5, taux d’erreur ~1% si (N)n avec n<9, taux d’erreur ~5%  Le taux d’erreur dépend de la fréquence des régions homopolymériques Ce n’est pas une valeur absolue

31 Evaluation des NTSs au Genoscope
Qualité : des lectures et des assemblages Applications : fonction de la taille des génomes, complémentarité aux autres technologies Impact sur l’obtention d’une séquence «finie »

32 De l’assemblage 454 au génome fini
Points positifs : Pas de clonage  présence des régions incompatibles avec E. coli Quasi-insensibilité aux biais compositionnels Vitesse : une semaine de l’ADN à la séquence Points négatifs: Pas de liens entre séquences  pas de supercontigage Taux d’erreur élevé dans les homopolymères pas d’assemblage des séquences répétées

33 Microbial Genome Sequencing
Until December 2006 : 12x coverage with Sanger technology, 3 libraries (insert sizes 3 kb, 10 kb, 40 kb) From january 2007 : 4x Sanger coverage, single library (10 or 40 kb) + 20x coverage GS20 reads Assembly with Arachne (Broad Institute) using Sanger reads and Newbler contigs From June 2007, 4x Sanger coverage, single library (10 or 40 kb) , + 15x coverage GSFLX reads Assembly with Arachne (Broad Institute) using Sanger reads and Newbler contigs or with Newbler2 using Sanger reads and GSFLX reads

34 Le séquenceur Solexa / illumina 1G
Amplification directe sur lames (pas de PCR en émulsion) Séquençage par terminateurs reversibles Longueurs de lecture : bases Débit : lectures / run

35 Applications du Solexa/Illumina 1G (ou ABI Solid)
SNP detection ChIp-Seq Quantitative / qualitative transcriptomics small RNAs …

36 Méthodes pour le re-séquençage :
environnement informatique Objectif : aligner chaque lecture à une localisation unique (si elle existe) sur le génome de référence Exemple si utilisation de blast : 1 lecture contre 140Mb (chr9 humain) ~ 18s/CPU 1 lecture contre 3Gb ~ 386s/CPU 1Gb lectures Solexa contre 3Gb ~ 490 années/CPU 20x de lectures Solexa contre 3 Gb ~ années/CPU Nécessité d’utiliser des méthodes différentes qui tiennent compte de la petite taille des lectures : phageAlign : compare chaque lecture avec les k-mers génomique (en triant les k-mers et en exploitant les parties communes des préfixes pour réduire le travail) ELAND : place les lectures dans une structure de données et les aligne toutes en même temps

37 Perspectives d’utilisation Solexa / Illumina 1G
Small RNAs, tags … : avantage de coût par rapport au 454/Roche Séquençage de génomes : attente du développement d’assembleurs adaptés Amélioration de la qualité des séquences 454/Roche assemblés

38 Notions de coût par base (ordre de grandeur)
Sanger (ABI3730xl) : 1000 euros / Mbase  taux d’erreur < 99%, assemblage de qualité à ~10 équivalents, supercontigage immédiat Roche/454 GSFLX : 100 euros / Mbase  taux d’erreur > 1% dans les régions homopolymériques, assemblage de qualité à ~20 équivalents, pas de supercontigage Illumina 1G : <10 euros / Mbase  taux d’erreur <99.9 % , pas d’assemblage de qualité …

39 4x 15x 0.5x 10-100x Assemblage, finition Assemblage, finition 15x

40 Evolution accélérée des NTSs
Roche / 454 2006 : 20 Mb par run (100 bases par lecture) 2007 : 100 Mb par run (250 bases par lecture) 2008 : 1 Gb par run (500 bases par lecture) Solexa/Illumina 1G 2007 : 1 Gb par run (32 bases par lecture) 2008 : 3 Gb par run (50 bases par lecture, lectures en paires)  Difficile de prévoir quelle technologie sera utilisée pour séquencer un génome dans 1-2 ans …

41 Vers un séquençage génomique à très bas coût
Dépendra de la capacité à assembler des séquences courtes et peu chères : Développement de lectures « paired-ends » ? Allongement des longueurs utiles de type Solexa ? Baisse des coûts des lectures 454 ? Amélioration spectaculaire des logiciels d’assemblage ? Arrivée d’une nouvelle technologie ?

42 Une perspective très mobile …
Les programmes de comparaison multi-génomes devraient se généraliser La métagénomique connaîtra un développement exponentiel De nombreux projets jugés jusqu’alors trop coûteux deviennent réalisables … Mais toutes ces perspectives nécessitent des progrès pour être envisageables pour des génomes de grande taille

43 Une perspective très mobile …
Les technologies utilisées peuvent devenir caduques très vite Les besoins informatiques augmentent considérablement Risque d’envahissement par des données massives de faible qualité

44 Director : J. Weissenbach
Sequencing coordination : P. Wincker Production Sequencing: J. Poulain Roche / 454 development : C. Cruaud Informatics: C. Scarpelli, V. Vico, V. Anthouard, J. Leseaux Assembly : J.M. Aury

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