Autoassemblage de macromolécules

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1 Autoassemblage de macromolécules
biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des nanotubes de carbone fonctionnalisés. Thèse de doctorat Jessica BAUR

2 Sommaire Introduction
Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les architectures biomoléculaires Conclusions et perspectives Remerciements 1

3 Introduction générale
Les biocapteurs SIGNAL Récepteur biologique Analytes Transducteur Electrochimique Gravimétrique Optique Oligo-sonde / oligo-cible Anticorps / antigène Substrat / enzyme … Film Thermique… Applications : sciences de la vie (agroalimentaire, médecine…), environnement (pollution), bioterrorisme Etape déterminante : immobilisation du biorécepteur sur le transducteur → poly(pyrroles) électrogénérés = versatilité, stabilité, conduction, adressage électrochimique Challenges : augmenter les performances (sensibilité, spécificité, stabilité…) et diminuer la taille → architectures tridimensionnelles à base de nanotubes de carbone 2

4 Introduction générale
Les polymères électrogénérés électropolymérisation S P greffage chimique S P adsorption S P adsorption greffage chimique électropolymérisation bonne accessibilité du site actif moyen non stabilité oui taux d’immobilisation faible fort dénaturation possible des biomolécules possible rapidité de mise en œuvre 3

5 Introduction générale
Les polymères électrogénérés ancrage par interactions affines S P S P encapsulation systèmes affins les + utilisés : avidine/biotine adamantane/b-cyclodextrine NTA/Cu2+/histidine encapsulation interactions affines bonne accessibilité du site actif moyen oui stabilité taux d’immobilisation fort dénaturation possible des biomolécules possible non rapidité de mise en œuvre 4

6 Introduction générale
Les nanotubes de carbone (CNTs) : présentation → Structure : feuillet de graphène enroulé « sans couture ». → Les deux types de CNTs : Single-Walled Carbon Nanotubes SWCNTs 200 nm Multi-Walled Carbon Nanotubes MWCNTs 200 nm 5

7 Introduction générale
Les nanotubes de carbone (CNTs) : présentation → Propriétés : Conductivités thermique et électrique, résistance mécanique, légèreté. avantage pour les biocapteurs ou les biopiles : haute surface spécifique (1000 m2.g-1) → Inconvénients : purification difficile et/ou coûteuse (carbone amorphe, graphite, particules de catalyseur…) solubilisation : mise au point d’un pré-traitement[1] sans prétraitement, SWCNTs dans le THF avec prétraitement, SWCNTs dans le THF [1] R. Haddad et al. Analyst 2009, 134, 6

8 Introduction générale
Les nanotubes de carbone (CNTs) : fonctionnalisation → Quelques méthodes : CNTs Fonctionnalisation non-covalente Fonctionnalisation des défauts électropolymérisation Fonctionnalisation covalente → Techniques utilisées : - fonctionnalisation non-covalente par p-stacking pour l’immobilisation de la GOX - combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour l’encapsulation d’une hydrogénase NiFe 7

9 Sommaire Présentation du poly(pyrrole-NTA) et généralités
Introduction Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules Présentation du poly(pyrrole-NTA) et généralités Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH Mise en évidence d’une nouvelle interaction Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les architectures biomoléculaires Conclusions et perspectives Remerciements 8

10 Le pyrrole-NTA : généralités
→ Structure[2] acide nitrilotriacétique = NTA → L’interaction NTA/Cu2+/histidine Biomolécules marquées avec des histidines immobilisées : → l’ADN du VIH capteur à ADN pour la détection du VIH → la glucose oxydase (enzyme modèle) biocapteur enzymatique pour la détection du glucose [2] N. Haddour et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 9

11 Le pyrrole-NTA : généralités
Formation du (poly)pyrrole : → augmentation du signal électroactif réversible du poly(pyrrole) → Etude électrochimique Signal irréversible du motif pyrrole [pyrrole-NTA] = mol.L-1, CH3CN + LiClO4 (0,1 mol.L-1), électrode Pt (Ø = 5 mm), v = 100 mV.s-1 → polymérisation du pyrrole-NTA → incubation avec Cu2+ (10-2 mol.L-1, 20 min) → incubation avec biomolécule marquée avec des histidines (0,5 mg.mL-1 ; 30 min) → Etapes pour l’immobilisation de biomolécules histidinylées électrode GOX 10

12 Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH
→ Caractérisation qualitative de l’interaction NTA/Cu2+/His-ADNsonde clichés de microscopie à fluorescence obtenus après incubation avec avidine-FITC et rinçage, électrode FITC électrode nue électrode recouverte de Ppyr-NTA après ancrage de His-ADNsonde sur le Ppyr-NTA capteur à ADN complet électrode électrode électrode séquence His-ADNsonde : 5′-NH2-(His)5-GAGACCATCAATGAGGAAGCTG-3′ 11

13 Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH
→ Caractérisation quantitative de l’interaction NTA/Cu2+/His-ADNsonde/ADNcible microbalance à quartz (QCM), quartz d’or modifiés par le poly(pyrrole-NTA)/Cu2+. Equation de Sauerbrey : Composé DF (Hz) m (ng) n (mol) nombre de brins His-ADNsonde 71 26 3, 2.1012 B-ADNcible 44 16 1, 9.1011 avidine 276 100 (a) His-ADNsonde, (b) B-ADNcible et (c) avidine recouvrement surface avec His-ADNsonde : 94 % pourcentage d’hybridation : 45 % angle surface-duplex d’ADN : 80 ° solutions dans le PBS (0,05 mol.L-1, pH = 7, NaCl 0,5 mol.L-1) ; débit : 50 µL.min-1 (a) : 0,01 mg.mL-1, (b) : 0,01 mg.mL-1 et (c) : 0,5 mg.mL-1 12

14 Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH
→ Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS) avantages : décomposition du processus électrochimique global en processus élémentaires et cible non marquée principe de la spectroscopie d’impédance électrochimique : choix de la sonde électrochimique : 1) Fe(CN)63/4- ( mol.L-1), Eapp = OCP / ECS et DE = 5 mV rms. 2 DE 2 DI Ec Ic I E représentation utilisée : plan complexe de Nyquist résistance trop importante : utiliser une sonde neutre Circuit électrique équivalent modèle W RTC Rel CDC ZW d Rd Re(Z) (W) - Im(Z) (W) f° 2) hydroquinone (10-3 mol.L-1), Eapp = 0,4 V / ECS et DE = 5 mV rms. gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz. 13

15 Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH
→ Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique [hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz. Ancrage de His-ADNsonde sur le Ppyr-NTA : Détection du phénomène d’hybridation de l’ADN : Ppyr-NTA Ppyr-NTA demi-cercle → RTC DRTC plus importante avec l’ADN complémentaire Solutions contenant 10-8 mol.L-1 d’ADN complémentaire ou non-complémentaire J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 14

16 Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH
→ Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique détermination de la limite de détection du capteur à ADN [hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz. DRTC augmente avec [ADNcible] [ADNcible] croissantes entre (a) et (f) 3, mol.L-1 courbe d’étalonnage : DRTC = f([ADNcible]). gamme de linéarité : à 10-8 mol.L-1 pente = 89,8 W.unité log-1 limite de détection : mol.L-1 J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 15

17 Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH
→ Etude du capteur à ADN par conductimétrie courbe d’étalonnage pour f = 3 Hz [hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz. DZ3Hz augmente avec [ADNcible] courbe d’étalonnage : DZ3Hz = f([ADNcible]). gamme de linéarité : à 10-8 mol.L-1 pente = 82,8 W.unité log-1 limite de détection : mol.L-1 J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 16

18 Mise en évidence d’une nouvelle interaction entre
NTA/Cu2+ et la molécule biotine → Interaction NTA/Cu2+/histidine performante pour l’immobilisation de l’ADN → Soupçons d’interaction entre le polymère et la biotine Démonstration qualitative de cette nouvelle interaction par microscopie à fluorescence : cliché obtenus après incubations avec GOX-B et l’avidine-FITC puis rinçage, Rappel : pas d’ancrage de l’avidine-FITC sur les électrodes ni sur le Ppyr-NTA/Cu2+ GOX électrode FITC NTA/Cu2+/(histidine)2 NTA/Cu2+/(biotine)2 [2] R. Griesser et al. Biochemistry 1970, 9, interaction entre l’atome S de la biotine et l’ion Cu2+ démontrée en 1970[2] 17

19 Mise en évidence d’une nouvelle interaction NTA/Cu2+/biotine
→ Etude de l’ancrage de l’ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique : Ancrage de B-ADNsonde sur le Ppyr-NTA : Ppyr-NTA Phénomènes d’ancrage et d’hybridation confirmés Comparaison des deux systèmes délicate (interaction et ADN différents) Utilisation d’enzyme (GOX) pour comparaison Détection du phénomène d’hybridation de l’ADN : [hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz. J. Baur et al. Electrochem. Commun. 2010, 12, 18

20 Comparaison des résultats obtenus pour l’immobilisation de la glucose oxydase (enzyme modèle)
électrode GOX GOX électrode Courbes typiques cinétique enzymatique : I = f([glucose]) → aux faibles [glucose] : partie linéaire initiale = sensibilité de l’électrode → aux fortes [glucose] : plateau = Jmax, saturation de l’enzyme en substrat. GOX électrode Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7). 19

21 Comparaison des résultats obtenus pour l’immobilisation de la glucose oxydase (enzyme modèle)
référence Système Ppy-NTA/Cu2+/ His-GOX B-GOX Ppy-NTA/Cu2+/ADNduplex/ avidine/B-GOX Ppy-biotine/ avidine/B-GOX [3] Jmax (µA.cm-2) 11,5 13,2 21,8 1 Jmax relatif 100 % 80 % 130 % 10 % sensibilité (mA.mol-1.L.cm-2) 0,5 0,6 0,9 0,15 sensibilité relative 125 % 40 % activité enzymatique en solution (U.mg-1) 150 220 110 Perméabilités : poly(pyrrole-NTA) : Pm = 10-1 cm.s-1 et poly(pyrrole-biotine) : Pm = 10-3 cm.s-1 (facteur 100) Performances similaires entre les systèmes NTA/Cu2+/histidine et NTA/Cu2+/biotine Meilleures performances en présence du duplex d’ADN → + d’enzymes immobilisées (ADN agit comme un éventail) [3] S. Cosnier et al. Anal. Chem. 1999, 71, 20

22 Conclusions 1ère partie : le poly(pyrrole-NTA)
Avantages du poly(pyrrole-NTA) : → bonne perméabilité du polymère et faible limite de détection → possibilité d’immobiliser des molécules marquées avec des histidines OU des biotines → adressage électrochimique propre aux polymères électrogénérés Avantages de l’interaction NTA/Cu2+/histidine : → réversibilité de l’interaction NTA/Cu2+/histidine Avantages du nouveau système NTA/Cu2+/biotine : → par rapport au système NTA/Cu2+/histidine : disponibilité commerciale des molécules biotinylées → par rapport au système classique avidine/biotine : meilleures performances → alternative séduisante au système avidine/biotine 21

23 Sommaire Fonctionnalisation multiple de CNTs
Introduction Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les architectures biomoléculaires Fonctionnalisation multiple de CNTs Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion d’une réductase Conclusions et perspectives Remerciements 22

24 → L’interaction CNT/pyrène :
→ Synthèse de pyrènes fonctionnalisés par des partenaires affins : Fonctionnalisation multiple des CNTs pour l’immobilisation d’enzymes (GOX) dépôt SWCNTs dispersés 20µL à 0,1 mg.mL-1 dans le THF séchage électrode répétition x2 → Procédure : trempage de l’électrode dans une solution contenant un ou des pyrènes fonctionnalisés mol.L-1 dans le THF 23

25 Fonctionnalisation simple des SWCNTs
Système adamantane/b-cyclodextrine électrode GOX Système NTA/Cu2+/histidine électrode GOX GOX électrode Système biotine/avidine/biotine solutions contenant un des 3 pyrènes ( mol.L-1) Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7). 24

26 Comparaison des résultats obtenus pour la fonctionnalisation simple des SWCNTs
référence Système Pyrène-NTA/ Cu2+/His-GOX Pyrène-adamantane/ b-CD-GOX Pyrène-biotine/ avidine/B-GOX Jmax (µA.cm-2) 44,8 (51 %) 135,4 (100 %) 5,1 (4 %) sensibilité (mA.mol-1.L.cm-2) 2,38 (45 %) 8,20 (100 %) 0,11 (1 %) seuil de détection (mol.L-1) 10-5 3,1.10-6 3,4.10-4 gamme de linéarité (mol.L-1) 10-5 – 6,3.10-3 3, – 9,4.10-3 3, – 1,2.10-2 activité de l’enzyme en solution (U.mg-1) 150 230 220 Système adamantane/b-cyclodextrine le plus performant Gammes de linéarité et seuil de détection similaires entre les systèmes adamantane/b-cyclodextrine et NTA/Cu2+/histidine Plus mauvais : avidine/biotine → phénomène d’écrantage dû à l’avidine 25

27 Fonctionnalisation multiple des SWCNTs
GOX avidine b-CD-GOX Cu2+ His-GOX GOX GOX B-GOX mélange équimolaire 1/1/1 des 3 pyrènes ( mol.L-1) Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7). 26

28 Fonctionnalisation multiple des SWCNTs
→ Résultats : → Démonstration possibilité de fonctionnaliser les SWCNTs avec les 3 systèmes affins considérés (NTA/Cu2+/His, avidine/biotine, adamantane/b-CD) par simple trempage. → Applications : détection multienzymatique à activités combinées, détection de plusieurs analytes… Enzyme b-CD-GOX B-GOX His-GOX Jmax (µA.cm-2) 5,3 8,4 13,5 sensibilité (mA.mol-1.L.cm-2) 0,30 0,53 0,59 seuil de détection (mol.L-1) 3,6.10-5 gamme de linéarité (mol.L-1) 3, – 6,3.10-3 3, – 1,6.10-2 activité de l’enzyme en solution (U.mg-1) 230 220 150 27

29 électrode de carbone vitreux
Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase → Combinaison performances CNTs et poly(pyrrole) H2ase électrode de carbone vitreux H2ase hydrogénase = viologène CNTs 3 clusters FeS site actif NiFe → L’hydrogènase NiFe de Desulfovibrio fructosovorans pour la bioconversion de l’énergie : Enzyme qui catalyse de façon réversible : H2 = 2 H+ + 2e- capacité double : - transformer H2 en énergie électrique - stocker H2 → Mode de fonctionnement pour l’oxydation de H2 (transfert d’électrons indirect) : électrode H2 2 H+ H2ase oxydée H2ase reduite MV2+ MV·+ e- 28

30 dépôt SWCNTs dispersés
Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase → Polymère choisi : le poly(pyrrole-viologène) viologène = médiateur pour le transfert électronique entre l’enzyme et l’électrode structure[4] : viologène = MV2+ (médiateur rédox) → Immobilisation par encapsulation dans le film de poly(pyrrole-viologène) sur des dépôts de CNTs : dépôt mélange H2ase + monomère dépôt SWCNTs dispersés H2ase électrode électro- polymérisation séchage séchage électrode électrode électrode électrode répétition (n fois) dépôt CNTs : n x 10µL à 0,1 mg.mL-1 dans le THF mélange H2ase (0,2 mg.mL-1) + pyrrole-MV ( mol.L-1) : 10 µL polymérisation : Eapp = 0,8 V / ECS, H2O + LiClO4 (0,1 mol.L-1). [4] S. Cosnier et al. J. Electroanal. Chem. 1997, 433, 29

31 électrode de carbone vitreux Meilleures performances
Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase → Etude sur électrode de carbone vitreux : H2ase électrode Jcat = 17 µA.cm-2 électrode de carbone vitreux → Etude sur électrodes de carbone vitreux modifiées par les CNTs : MWCNTs SWCNTs H2ase électrode H2ase hydrogénase = viologène CNTs Jcat = 103 µA.cm-2 Jcat = 301 µA.cm-2 Meilleures performances avec les MWCNTs quantités d’enzyme et de monomère constantes, dégazage Ar 30 min, H2 30 min puis activation H2ase : Eapp = - 0,8 V / ECS (15 min) dans le tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7) et étude dans la même solution par CV et enfin Ar 15 min puis CV. 30

32 Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase
→ Caractérisation par microscopie électronique à balayage (MEB) : SWCNTs MWCNTs 200 nm 200 nm avant polymérisation 200 nm 200 nm après polymérisation Surface « lissée » avec les SWCNTs Conservation de la porosité avec les MWCNTs ↔ meilleures performances 31

33 Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase
→ Evolution de l’intensité catalytique en fonction de la quantité de MWCNTs : Partie linéaire courbe Jcat = f(quantité MWCNTs) linéaire entre 10 et 50 µL de MWCNTs déposés quantités d’enzyme et de monomère constantes, seul VMWCNTs change partie anodique des courbes de voltampérométrie cyclique Probablement dû à : augmentation de la surface spécifique des électrodes due aux MWCNTs, meilleure perméabilité, transfert d’électrons facilité du fait d’une meilleure conduction… 32

34 Conclusions 2ème partie : les nanotubes de carbone
Fonctionnalisation multiple de SWCNTs : → mise en œuvre simple par trempage → possibilité de fonctionnalisation avec 3 systèmes affins différents Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase → résultats préliminaires mais prometteurs → augmentation du signal obtenu après dépôt de CNTs en général et plus particulièrement avec les MWCNTs Nanotubes de carbone : → augmentation de la surface spécifique des électrodes → augmentation de la conduction et de la perméabilité des films 33

35 CONCLUSIONS GENERALES
PERSPECTIVES Poly(pyrrole-NTA) : NTA/Cu2+/biotine → réversibilité, → utiliser dans des biocapteurs (Ab/Ag, ADN…), → taux de recouvrement de surface. CNTs : → architecture multifonctionnelle : applications diverses, → connexion d’une hydrogénase NiFe : optimisation du système. Potentiel des films de poly(pyrrole) et des nanotubes de carbone pour : → augmenter sensibilité et seuil de détection des architectures biomoléculaires → immobilisation de biomolécules en général → réaliser systèmes multifonctionnels → combinaison des deux : amplification des performances 34

36 Merci pour votre attention!
Remerciements Jury : Rapporteurs : Dr. Elisabeth Lojou et Pr. Alexander Kuhn Examinateurs : Dr. Gérard Bidan et Pr. Pierre Gros Département de Chimie Moléculaire Equipe BEA : Directeurs de thèse : Dr. Serge Cosnier et Dr. Michael Holzinger, Dr. Chantal Gondran, Arielle Le Pellec, Dr. Alan Le Goff, Dr. Karine Gorgy Permanents et étudiants du DCM Merci pour votre attention! 35

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38 Fonctionnalisation simple des SWCNTs
Système Pyrène-NTA/ Cu2+/His-GOX Pyrène-adamantane/ b-CD-GOX Pyrène-biotine/ avidine/B-GOX temps de réponse (s) 10 30 20 Jmax (µA.cm-2) 44,8 (51 %) 135,4 (100 %) 5,1 (4 %) sensibilité (mA.mol-1.L.cm-2) 2,38 (45 %) 8,20 (100 %) 0,11 (1 %) seuil de détection (mol.L-1) 10-5 3,1.10-6 3,4.10-4 gamme de linéarité (mol.L-1) 10-5 – 6,3.10-3 3, – 9,4.10-3 3, – 1,2.10-2 KM apparent (mol.L-1) 11,8.10-3 1,6.10-3 66,4.10-3 activité de l’enzyme en solution (U.mg-1) 150 230 220

39 Connexion d’une hydrogénase NiFe sur les MWCNTs
→ Etude de l’évolution du signal de Fe(CN)64- en fonction de la quantité de MWCNTs : Courbe I(Fe(CN)64-) = f(quantité MWCNTs) linéaire entre 10 et 60 µL de MWCNTs déposés. Confirme l’hypothèse d’augmentation de la surface spécifique des électrodes due aux MWCNTs mais ne la valide pas : vérifier absence d’accumulation de Fe(CN)64- dans les MWCNTs.