Michaël Suissa Sous la direction de : M. Eric Freyssingeas

Présentation au sujet: "Michaël Suissa Sous la direction de : M. Eric Freyssingeas"— Transcription de la présentation:

1 Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante : étude par diffusion dynamique de la lumière
Michaël Suissa Sous la direction de : M. Eric Freyssingeas Laboratoire de Physique et M. Christophe Place Laboratoire transdisciplinaire Joliot-Curie

2 Dynamique interne du noyau d’une cellule
vivante. CELLULE : unité de structure fondamentale de la plupart des organismes vivants. 2 types de cellules: Procaryotes : sans noyau (bactéries,…) Eucaryotes : disposant d’un noyau (hommes, animaux, plantes,…) Noyau : délimité par la membrane nucléaire Noyau contient ADN, support information génétique. Découverte récente : grande organisation structurelle et dynamique MODIFICATION DE L’ORGANISATION SPATIALE ET TEMPORELLE DU NOYAU = MODIFICATION DE L’ETAT CELLULAIRE

3 Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante.
Microscopies -> vision globale de la structure, développer une technique -> approche globale de la dynamique interne du noyau Idée : mesurer les fluctuations; en sortir des informations sur l’ensemble des propriétés dynamiques internes Projet : étudier la dynamique du noyau d’une cellule vivante par : Diffusion Dynamique de la Lumière.

4 Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES

5 Unité de base : nucléosome
I> Introduction 1) Le noyau Contient ADN sous forme compactée : la chromatine Molécule d’ADN + protéines (histones, …) CHROMATINE Unité de base : nucléosome

6 1) Le noyau I> Introduction
Répartition de la chromatine dans le noyau non aléatoire : dans territoires chromosomiques (Manuelidis, 1985 et 1990) Territoires chromosomiques Reconstruction en 3D de la répartition des territoires chromosomiques dans le noyau d’un fibroblaste (Bolzer et al., 2005)

7 1) Le noyau I> Introduction
Territoires chromosomiques entourés par espace interchromosomique (Cremer et Cremer, 2001) : éléments nécessaires à l’expression des gènes et à la réplication de l’ADN Pores nucléaire Territoires chromosomiques Chromatine Espace interchromosomique Corps nucléaires Protéines Polymérases ARN Nucléotides

8 10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ 9.10-14 m2.s-1 ; (Shav-Tal et al., 2004).
I> Introduction 2) Dynamique du noyau Mouvement des territoires chromosomiques dans le noyau. (Belmont, 2001) Dans territoires chromosomiques : Mouvement de la chromatine à l’intérieur du territoire chromosomique. (Belmont et al., 2001, 2003). Changement de « structure » de la chromatine : Décondensation et condensation de la chromatine pour permettre la transcription, la réplication et les réparations de l’ADN. Dans espace interchromosomique : Mouvement de diffusion des protéines et des complexes ARN-protéines à l’intérieur du noyau : Mesure du coefficient de diffusion D de ces « objets » : 10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ m2.s-1 ; (Shav-Tal et al., 2004). Réactions biochimiques.

9 DIFFUSION DYNAMIQUE DE LA LUMIÈRE
I> Introduction 2) Dynamique du noyau BIOLOGIE PHYSIQUE Chromatine Polymère Protéines Particules colloïdales Technique physique adaptée pour analyse dynamique polymères, particules colloïdales : DIFFUSION DYNAMIQUE DE LA LUMIÈRE Noyau => Système hors équilibre car système actif : activité biochimique continuelle ; en permanence réactions chimiques consommant de l’énergie et produisant de la chaleur (en particulier, synthèse de l’ARN : transcription, et de l’ADN : réplication).

10 3) Diffusion dynamique de la lumière
I> Introduction 3) Diffusion dynamique de la lumière DDL : Technique sensible aux variations spatio-temporelles n(r,t) de l’indice de réfraction n du milieu traversé par la lumière.  i.e. de la composition, de la concentration, de l’organisation du milieu. POUR NOYAU : mouvements et changements de structure de la chromatine, diffusion des complexes de macromolécules, réactions biochimiques.

11 4) DDL par le noyau d’une cellule vivante
I> Introduction 4) DDL par le noyau d’une cellule vivante DDL Information globale sur la dynamique du noyau Avantages de la DDL pour la dynamique du noyau : Mesures globales ; pas uniquement informations sur « objets » fluorescents. Mesure physique non-invasive et non-destructrice pour la cellule, contrairement aux expériences de fluorescence ; si bon choix de la longueur d’onde et de la puissance. Temps caractéristiques accessibles de 10-5 s à 10 s et, échelle de l’ordre de quelques 500 nm. Analyse des variations temporelles de l’intensité de la lumière diffusée par le noyau au cours d’un processus particulier : le cycle cellulaire

12 4) DDL par le noyau d’une cellule vivante
I> Introduction 4) DDL par le noyau d’une cellule vivante Phénomène fondamental : le cycle cellulaire Termine la division cellulaire Déclenche l’anaphase et conduit à la cytodiérèse Assemble le fuseau mitotique, prépare la cellule à la mitose Déclenche la machinerie de réplication de l’ADN; Réplique l’ADN Cycle cellulaire, 4 phases différentes : G1, S, G2 et M. Effet du cycle cellulaire sur la dynamique interne du noyau ?

13 Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES

14 II> Montage expérimental et protocoles
1) Principe du montage expérimental Cellules immobiles car adhérentes

15 1) Principe du montage expérimental
II> Montage expérimental et protocoles 1) Principe du montage expérimental 2 types de contraintes expérimentales à satisfaire : Contrainte « physiologique » : Environnement physiologique des cellules doit permettre développement normal des cellules pendant les expériences (de quelques heures à quelques jours). Contraintes « optiques » : a)Viser le noyau d’une cellule b) Focaliser le faisceau laser sur le noyau d’une cellule (5 m ≤ diamètre noyau ≤ 10 m). c) Faire l’image du volume illuminé par le laser sur un détecteur.

16 2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture
II> Montage expérimental et protocoles 2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture Cellules dans milieu de culture DMEM avec HEPES (pour préserver le pH). 1°) Chambre de culture placée horizontalement dans incubateur ; adhésion des cellules sur lamelle inférieure en 3 heures 2°) Chambre de culture placée, verticalement, dans « étau » thermostaté.

17 2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture
II> Montage expérimental et protocoles 2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture Cellules SHEP visualisées 48h après introduction dans chambre de culture A t=0, confluence = 1/3 Objectif x10 Excellente survie et prolifération des cellules 20 µm

18 3) Contraintes « optiques »
II> Montage expérimental et protocoles 3) Contraintes « optiques » Diamètre noyau 6-7 µm focalisation faisceau laser avec objectif microscope. Recueillir lumière diffusée selon plusieurs angles : -> Montage à l’horizontal, -> Diffusion de la lumière « vers l’avant ».

19 3) Contraintes « optiques »
II> Montage expérimental et protocoles 3) Contraintes « optiques » Puissance irradiation 0,1 - 0,5 mW Angle de diffusion variable Noyau Laser

20 4) Validation du montage
II> Montage expérimental et protocoles 4) Validation du montage Mesures sur différents systèmes : Mesures sur sphères de latex diluées ( 220 nm) avec focalisation laser à 1-2 m de la parois : beaux signaux mono-exponentiels ; Diffusion homodyne. 2) Fonctions d’auto-corrélation mesurées pour différentes positions de focalisation du laser Dans la cellule. I(noyau) = u. a I(cyto.) = 5-20 u. a Dans le milieu. I = 1-2 u. a.

21 Pour notre étude : cellules neuroblastomes
II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes Pour notre étude : cellules neuroblastomes de la lignée SHEP SHEP : Neuroblastes (précurseurs des neurones) cancéreux. SHEP ? Adhérentes, gros noyau, cycle cellulaire continu et régulier (durée = 15 heures), … Aussi culture simple, « robustes ».

22 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes Population « normale » de SHEP : 25 % G2+M 60 % G0/1 15 % S Problème : synchroniser les cellules dans le cycle pour connaître la phase du cycle des cellules à l’instant de la mesure. Blocage des cellules en fin de G1 par utilisation de HU. (HU : Hydroxyurée  Molécule à effet cytobloquant ; empêche la cellule d’entrer en phase S) Puis redémarrage synchronisé (« en phase ») après élimination de HU.

23 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes Etudier effet HU sur le cycle cellulaire des SHEP par cytométrie en flux MAIS Cytométrie en flux sur cellules en boîte de Pétri dans incubateur CO2 Conditions différentes de notre montage : lame de verre, sans CO2 En parallèle Etude par expériences de cytométrie en flux Observations visuelles d’échantillons placés dans le montage

24 Intensité fluorescence
II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes Détermination de la proportion de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire par cytométrie en flux • Un intercalant fluorescent de l’ADN est ajouté à une suspension « cellulaire ». • Les cellules sont irradiées par un laser qui excite le colorant. • L’intensité de fluorescence émise par le noyau est mesurée. Pic G0/1 Nombre de cellules Phase S Pic G2+M La cytométrie en flux permet de déterminer la « quantité » d’ADN présente dans la cellule Intensité fluorescence Contenu en ADN

25 Pas de mitose Non éliminé 48 heures Elimination HU
Par cytométrie en flux Dans le montage Pas de mitose Non éliminé 48 heures

26 80% des cellules entrent en mitose à t0+17 heures
Elimination HU Par cytométrie en flux Dans le montage Pas de mitose Non éliminé 48 heures 80% des cellules entrent en mitose à t0+17 heures Eliminé après 10 heures (t0)

27 80% des cellules entrent en mitose entre t0+9 et t0+10 heures
Elimination HU Par cytométrie en flux Dans le montage Pas de mitose Non éliminé 48 heures 80% des cellules entrent en mitose entre t0+9 et t0+10 heures Eliminé après 15 heures (t0)

28 HU éliminé après 10 heures
Mesures G0/1 Mesures S Mesures G2 Mesures M

29 Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES

30 III> Résultats Signal non stationnaire :
Modulations sur temps longs (plusieurs dizaines de secondes) Variations brutales d’intensité (toutes les 7-8 s) Fluctuations Dynamique complexe : plusieurs temps caractéristiques, de quelques ms à plusieurs dizaines de secondes

31 Fonction d’auto-corrélation
III> Résultats Principe autocorrélation : comparer fonction avec une version décalée d’elle même en temps. <I(0)I(t)> Fonction d’auto-corrélation mesurée à  = 21°.

32 Fonction d’auto-corrélation
III> Résultats 2 temps caractéristiques  Ajustement par fonction : (A1.exp(-(t/1)) + A2.exp(-t/2))2 + B. (<N>) Fonction d’auto-corrélation mesurée à  = 21°.

33 Premières observations :
III> Résultats Premières observations : • Variations importantes de <N>. • A2 > A1 ; A1 de 5 à 25 % de l’amplitude du signal dynamique. • Pas de corrélation entre <N> et 1, ou 2. • Pas de corrélation entre A1 et 1, ni entre A2 et 2. • Pas de corrélation entre 1 et 2 ; processus de relaxation indépendants. • 0,4 ≤  ≤ 1 ; pas de corrélation entre  et 1.

34 III> Résultats : temps t1 (qualitatif)

35 III> Résultats : temps t1 (qualitatif)

36 III> Résultats : temps t1 (qualitatif)

37 III> Résultats : temps t1 (quantitatif)
Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10-3 s] Pics [10-3 s] G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55)

38 III> Résultats : temps t1 (quantitatif)
Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10-3 s] Pics [10-3 s] G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55)

39 20; 40; (55) G0/1 15-70 (182/24) 20; (15); (35-40) S 5-40 (252/44)
III> Résultats : temps t1 (quantitatif) Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10-3 s] Pics [10-3 s] G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55) S (252/44) 5-40 20; (15); (35-40)

40 G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55) S (252/44) 5-40 20; (15); (35-40) G2
III> Résultats : temps t1 (quantitatif) Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10-3 s] Pics [10-3 s] G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55) S (252/44) 5-40 20; (15); (35-40) G2 (138/18) 5-30 10; 25

41 G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55) S (252/34) 5-40 20; (15); (35-40) G2
III> Résultats : temps t1 (quantitatif) Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10-3 s] Pics [10-3 s] G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55) S (252/34) 5-40 20; (15); (35-40) G2 (138/18) 5-30 10; 25 M (42/6) 10

42 III> Résultats : temps t1
Dynamique complexe : Pour toutes les phases distributions différentes certainement dues à différents processus biologiques. t1 plus court plus on avance dans le cycle cellulaire. Relaxation rapide associée à exponentielle étirée (0,4 < a < 1) => Distribution large de temps caractéristiques Explication possible : Nombreux processus dans le noyau = succession de processus hiérarchisés avec temps caractéristiques différents : analogie possible avec le « vieillissement » (Castaing et Souletie, 1991). => Distribution log-normale des temps de relaxation t1 et a liés à la moyenne et à l’écart type de la distribution A l’heure actuelle, pas de lien entre les distributions de 1 et un, ou plusieurs, processus biologiques

43 Phase CC Echelle Valeurs [s] Pics [s]
III> Résultats : temps t2 Phase CC Echelle Valeurs [s] Pics [s] G0/1 0,2-2 0,5 S 0,2-1,2 0,45 G2 0,5-2 0,75; (1,5-2) M 0,3-1 0,75

44 10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ 9.10-14 m2.s-1 (Shav-Tal et al., 2004).
III> Résultats : temps t2 Estimation temps de relaxation lent peu précise <= problème estimation ligne de base Néanmoins : Pour toutes les phases, distribution ajustable par loi log-normale. Différences entre les distributions de chaque phase : différences moins prononcées que pour t1. Origines possibles de ce temps de relaxation : Diffusion de complexes ARN-Protéines : 10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ m2.s-1 (Shav-Tal et al., 2004).  temps de relaxation, 1/Dq2 (avec q vecteur d’onde ; dépend de l’angle de diffusion). Ici : q2 ≈ 2, m-2 => dans la gamme : 0,5 - 4 sec. Mouvement de la chromatine à l’intérieur des territoires chromosomiques (Levi et al., 2005) ; temps de relaxation attendus : ~ la seconde.

45 Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES

46 Analyse par autocorrélation
V> Conclusions et perspectives 1) Conclusions DDL Mise au point d’un montage expérimental original et protocoles Dynamique complexe : plusieurs temps caractéristiques, de quelques ms à plusieurs dizaines de secondes Analyse par autocorrélation 2 temps caractéristiques indépendants Temps rapide : quelques dizaines de millisecondes, distribution très différente selon phase du cycle cellulaire, signature de relaxations s’effectuant par un ensemble de processus hiérarchisés Temps lent : de l’ordre de la seconde distributions changent légèrement au cours du cycle cellulaire gamme de temps compatible avec résultats sur diffusion de complexes ARN-protéines dans le noyau.

47 • Travailler sur le signal brut de l’intensité diffusée.
V> Conclusions et perspectives 3) Perspectives DDL • Travailler sur le signal brut de l’intensité diffusée. • Trouver des liens entre la dynamique du noyau et des processus biologiques. Utilisation d’agents pharmacologiques pour bloquer des processus bien particuliers et analyser la nouvelle dynamique Coupler les mesures de diffusion avec des mesures de fluorescence  Lien entre dynamique et activité biochimique. • Mesurer la dynamique sur d’autres systèmes : apoptose, autres lignées cellulaires que les SHEP, à l’intérieur du cytoplasme.

48 Phénomène inattendu : quand une cellule entre en apoptose
V> Conclusions et perspectives Phénomène inattendu : quand une cellule entre en apoptose après avoir été irradiée, plusieurs voisines entrent également en apoptose

49 V> Conclusions et perspectives
Etude du mode de transmission de la mort par apoptose.

50 V> Conclusions et perspectives
Contact ou diffusion ? Séparation des cellules grâce à des motifs carrés Objectif x10 Objectif x40 250 µm 50 µm

51 REMERCIEMENTS Equipe E. Goillot : support pour partie bio
M. B. Berge : idée originale M. J.F. Palierne : aide pour acquisition du signal M. P. Borgnat : aide pour traitement du signal Mme M. Barbi : démarrage de l’expérience

52 Evolution de la distribution des temps caractéristiques t1
en fonction de l’angle de diffusion

53 Evolution de la distribution des temps caractéristiques t2
en fonction de l’angle de diffusion

54 Evolution de la distribution du coefficient d’étirement a
au cours du cycle cellulaire

55 Evolution de la distribution de <N> au cours du cycle cellulaire

56 1 seul temps caractéristique « lent » entre : 0,1 s et 5 s
Fonction d’autocorrélation de l’intensité de la lumière diffusée par le cytoplasme d’une cellule en phase G1 (ajustement par cumulants) 1 seul temps caractéristique « lent » entre : 0,1 s et 5 s