Soutenance de thèse : 5 Juin 2009

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1 Soutenance de thèse : 5 Juin 2009
Anne-Laure RAFFIN Phénotypage de la réparation de l’ADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test in vitro multiparamétrique Thèse préparée au laboratoire Lésions des Acides Nucléiques Directrice de thèse: Dr. Sylvie SAUVAIGO

2 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
PLAN Introduction La réparation de l’ADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de l’ADN Objectifs Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

3 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
PLAN Introduction La réparation de l’ADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de l’ADN Objectifs Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

4 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Introduction: la réparation de l’ADN L’ALTÉRATION DE LA MOLÉCULE D’ADN Lésion de l’ADN Source de dommages Double hélice d’ADN ADN lésé Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

5 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Introduction: la réparation de l’ADN LES RÉPONSES CELLULAIRES FACE AUX DOMMAGES DE L’ADN Source endogène ou exogène de dommage cellule Arrêt réplication Lésions de l’ADN Arrêt de la transcription Apoptose Réparation de l’ADN Mutagénèse Restauration de la séquence d’ADN Reprise du cycle cellulaire Cancérogenèse Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

6 LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN
Introduction: la réparation de l’ADN LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN Site abasique Adduits volumineux Pontages intra et inter-brin mésappariement X X X X X X G C U X (CH3)n T T X A CH3 Uracile Modification de la base Alkylation Dimère de Pyrimidine Coupure double brins O6 methyl guanosine Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

7 Modification de la base
Introduction: la réparation de l’ADN LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN Site abasique Adduits volumineux Pontages intra et inter-brin mésappariement X X X X X X G C U X (CH3)n T T X A CH3 Uracile Modification de la base Alkylation Dimère de Pyrimidine Coupure double brins O6 methyl guanosine Petites lésions: modifient la structure chimique des composants de l’ADN mais ne déforment pas la double hélice Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

8 Pontages intra et inter-brin
Introduction: la réparation de l’ADN LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN Site abasique Adduits volumineux Pontages intra et inter-brin mésappariement X X X X X X G C U X (CH3)n T T X A CH3 Uracile Modification de la base Alkylation Dimère de Pyrimidine Coupure double brins O6 methyl guanosine Lésions volumineuses: modifient la structure chimique des composants de l’ADN et déforment la double hélice Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

9 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Introduction: la réparation de l’ADN LES DIFFÉRENTS VOIES DE RÉPARATION DE L’ADN BER NER NHEJ / HR MMR DR X X X X X X G C U X (CH3)n T T X A CH3 BER: Base Excision Repair NER: Nucleotide Excision Repair NHEJ: Non-Homologous End joining HR: Homologous Recombination MMR: MisMatch Repair DR: Direct Reversal Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

10 BER NER LES ÉTAPES ET FACTEURS DE LA BER ET DE LA NER
Introduction: la réparation de l’ADN LES ÉTAPES ET FACTEURS DE LA BER ET DE LA NER Reconnaissance du dommage BER NER XPC, (XPE), XPA and TFIIH Glycosylases Excision du dommage Glycosylases + AP endonucléase Endonucléases XPG et XPF-ERCC1, XPA Resynthèse de l’ADN Polymérases δ, ε, RPA, XPA? Polymérase β + Polymérases δ, ε Ligature Ligase I Ligase III ou I Base Excision Repair Nucleotide Excision Repair GG et TC-NER Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

11 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Introduction: la réparation de l’ADN LES ADN N-GLYCOSYLASES ET L’APE1 Substrats: petites lésions de l’ADN Fonction des ADN N-glycosylases: coupure de la liaison N-Glycosidique Spécificité des ADN N-Glycosylases: un type de dommage ou un groupe de dommages Exemple d’ADN N-Glycosylases: UNG (Uracile), OGG1 (8-oxoG), NTH1 (Diol de Thymine, 5 Formyluracile), NEIL1 (Diol de Thymine, Fapy-A, Fapy-G, 8-oxoG) Fonction de APE1 et des ADN N-Glycosylases bifonctionnelles : coupure de la liaison phosphodiester Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

12 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Introduction: la réparation de l’ADN LES RÔLES DE XPA ET XPC Substrats: lésions volumineuses de l’ADN XPC: Spécificité d’intervention: uniquement réparation globale du génome Fonction: Reconnaissance de l’ADN endommagé (1er facteur à intervenir) XPA: Spécificité d’intervention: réparation globale du génome et réparation couplée à la transcription Interactions avec d’autres facteurs de la NER: TFIIH, ERCC1 et RPA Fonction(s): « Chef d’orchestre » de la NER: de la reconnaissance du dommage à la resynthèse de l’ADN = Rôle complexe qui reste encore à clarifier Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

13 BER NER LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION
Introduction: la réparation de l’ADN LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION BER NER Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997) XPC stimule activité de la TDG (Schimizu et al., 2003), OGG1 (d’Errico et al., 2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008) hHR23 (A et B) stimule MPG (Miao et al., 2000) RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000) XPG stimule NTH1 (Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999) Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydatif que des cellules saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008)

14 BER NER LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION
Introduction: la réparation de l’ADN LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION BER NER Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997) XPC stimule activité de la TDG (Schimizu et al., 2003), OGG1 (d’Errico et al., 2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008) hHR23 (A et B) stimule MPG (Miao et al., 2000) RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000) XPG stimule NTH1 (Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999) Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydant que des cellules saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008)

15 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Introduction: le Xeroderma pigmentosum LES CARACTÉRISTIQUES DU XERODERMA PIGMENTOSUM 1968: relation XP – déficience de la NER (Cleaver 1968) 7 groupes XP (A à G): déficience d’une protéine de la NER + XPV Hypersensibilité aux UV : apparition de lésions pigmentaires dès le plus jeune âge Apparition cancer: risque multiplié par Tumeurs de la peau vers l’âge de 8 ans (Daya-Grosjean et al. 1995) Certaines formes: troubles neurologiques Espérance de vie: ans (XP classiques) (de Boer and Hoejmakers 2000) Pas de traitement Diagnostic: test UDS (Unscheduled DNA Synthesis) Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

16 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Introduction: Les outils pour étudier la réparation LES AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS DES TESTS DE MESURE DE LA RÉPARATION DE L’ADN Vision minimaliste de la réparation de l’ADN: une lésion étudiée à la fois Test in vitro sur support permettant une mesure conjointe de la réparation de plusieurs lésions à partir d’un seul lysat cellulaire Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

17 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
PLAN Introduction La réparation de l’ADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de l’ADN Objectifs Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

18 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Objectifs LES OBJECTIFS DE L’ÉTUDE Proposer un outil de diagnostic de la maladie XP alternatif à l’UDS Fiabilité Rapidité Sensibilité Peu de cellules Utiliser l’outil « puce réparation » pour caractériser des phénotypes de réparation de l’ADN de lignées XP Etudier la réparation de l’ADN de lignées XPA et XPC Quel est le niveau basal de réparation? Influence de la concentration protéique Quelle est la réponse à un traitement génotoxique? UVB Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

19 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
PLAN Introduction La réparation de l’ADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de l’ADN Objectifs Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

20 LA PRÉPARATION DES LYSATS CELLULAIRES
Matériels et Méthodes LA PRÉPARATION DES LYSATS CELLULAIRES 3 à 5 x 106 cellules (Test en solution de Wood et al.: 109 cellules) Congélation DMSO+SVF+milieu Fibroblastes SV40 de patients XP Tampons ioniques Protéines Test in vitro de la réparation dosage Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

21 Excision des lésions + Resynthèse
Matériels et Méthodes LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION [support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!! Puce Plasmide Puce Oligo lésions plasmide surface de la biopuce incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5 Excision des lésions + Resynthèse Gain de fluorescence Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

22 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Matériels et Méthodes LES LÉSIONS DE LA PUCE PLASMIDE 8oxoGuanine Diols de pyrimidine 6-4 PP Photoproduits + T-T CPD N O H R Bases alkylées Adduits Cisplatine G Pt NH2 AT CTAGCATGGCC TACGA CGT CCGG Sites abasiques Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

23 (Excision-Resynthèse)
Matériels et Méthodes PARAMÈTRES MESURÉS Quantification de la fluorescence totale Part relative de l’intensité de fluorescence des différentes lésions Soustraction du contrôle Somme des Intensité de fluo pour la même lésion Profil d’ER (Excision-Resynthèse) Phénotype de réparation Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

24 Excision des lésions + Resynthèse
Matériels et Méthodes LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION [support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!! Puce Plasmide Puce Oligo Gain de fluorescence lésions plasmide surface de la biopuce incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5 Excision des lésions + Resynthèse fluorophore Cy3 lésions oligonucléotide surface de la biopuce incubation avec lysat cellulaire Excision des lésions Perte de fluorescence Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

25 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Matériels et Méthodes LES ACTIVITÉS ENZYMATIQUES MESURÉES AVEC LA PUCE OLIGO - NTH1: Diol de thymine, Dihydrothymine NEIL1?: Diol de thymine, Dihydrothymine UNG: Uracile (U-A ou U-G) SMUG1: Uracile (U-A ou U-G) TDG: Mésappariement G-T MBD4: Mésappariement CG-GT MPG: Ethénoadénine APE1: THF (équivalent site abasique) Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

26 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
PLAN Introduction La réparation de l’ADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de l’ADN Objectifs Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

27 Résultats: Niveau basal de réparation
PHÉNOTYPE D’EXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (1) Lysat témoin 0,3 mg/mL Déficience pour la réparation des lésions prises en charge par la BER et la NER Implication de la protéine XPC dans la réparation des petites lésions Phénotype XPC ≠ Phénotype Témoin Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

28 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Niveau basal de réparation PHÉNOTYPE D’EXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (2) Lysat témoin 0,3 mg/mL Phénotype XPA = Phénotype Témoin à cette concentration protéique Rôle de XPA dans la réparation de la 8-oxoG? Pas de rôle établi dans la littérature (Klein et al., 1992; Dusinska et al., 2006 ≠ Rünger et al., 1995) Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

29 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Niveau basal de réparation PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DE L’ADN DE LYSATS TOTAUX Lysat témoin XPC 85% XPA 100% ER XPC = 85 % du témoin ER XPA = 100 % du témoin La discrimination des phénotypes XP est encore plus difficile avec les lysats totaux Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

30 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Niveau basal de réparation PHÉNOTYPE D’EXCISION DE LYSATS NUCLÉAIRES Le lysat XPA excise les diols de thymine avec une plus faible efficacité que le lysat témoin: interaction XPA avec NTH1, NEIL1? - Activités glycosylases et APE1 équivalentes dans tous les lysats testés sauf pour l’excision des diols de thymine Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

31 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Niveau basal de réparation CONCLUSIONS NIVEAU BASAL DE RÉPARATION Niveau basal + concentration standard de protéines XPC < Témoin XPA = Témoin XPC joue un rôle dans la réparation des petites lésions BER et XPA? ? Faire varier des paramètres expérimentaux pour gagner de l’information Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

32 PARAMÈTRES MESURÉS EN RÉPONSE AUX UVB
Résultats: Effet d’une irradiation UVB PARAMÈTRES MESURÉS EN RÉPONSE AUX UVB Exposition des cellules aux UVB (attention à la confluence) 0, 5 et 20 J/m² 24 h Cytotoxicité (test MTT) Cycle cellulaire (Cytométrie en flux) Réparation de l’ADN (test in vitro d’ER) Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

33 CYTOTOXICITÉ 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB
Résultats: Effet d’une irradiation UVB CYTOTOXICITÉ 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB Les cellules XP sont plus sensibles aux UVB Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

34 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB 0J/m² 20J/m² ** ** Fibroblastes 0 J/m² 5 J/m² 20 J/m² * ** * * * ** ** ** ** 0J/m² 20J/m² 0J/m² 20J/m² Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

35 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB ** ** Fibroblastes 0 J/m² 5 J/m² 20 J/m² * ** * * * ** ** ** ** Les cellules XP réagissent différemment des cellules témoin suite aux UVB XPC  XPA 5 J/m² Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

36 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H) Stimulation Inhibition Après l’irradiation UVB des cellules : Stimulation de l’ER avec le lysat nucléaire témoin Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

37 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H) Stimulation Inhibition Après l’irradiation UVB des cellules : Peu ou pas d’effet de l’irradiation sur la réparation des lysats XP Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

38 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet d’une irradiation UVB CONCLUSIONS RÉPONSE AUX UVB Rappel: Sans irradiation, XPA = Témoin UVB + concentration standard de protéines Stimulation des activités d’ER avec le lysat nucléaire témoin Pas de stimulation pour les lysats XP Meilleure discrimination des phénotypes de réparation après un traitement préalable des cellules Translocation des protéines de réparation vers le noyau en réponse à un traitement génotoxique: XPA (Wu et al., 2007), XPD (Fung et al., 2008) Néo-synthèse des protéines de la réparation en réponse à l’irradiation UV Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

39 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
PLAN Introduction La réparation de l’ADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de l’ADN Objectifs Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

40 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet de la concentration protéique EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (1) Lysat nucléaire témoin 0,9 mg/mL protéines 0,3 mg/mL protéines Plus de protéines: cinétique différente suivant les lésions (vitesse initiale, plateau, allure biphasique) Mécanismes différents suivant la concentration? Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

41 Lysat nucléaire témoin
Résultats: Effet de la concentration protéique EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (2) Lysat nucléaire témoin 0,3 mg/mL 0,9 mg/mL Augmentation de la part relative d’ER des photoproduits, des adduits du cisplatine et de la 8-oxoG Activités NER et réparation de la 8-oxoG favorisées à forte concentration Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

42 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet de la concentration protéique EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LES PHÉNOTYPES DE RÉPARATION XP Lysat XPA Nette diminution du niveau relatif de réparation de XPA à partir de 0,7 mg/mL (sauf pour les diols de pyrimidine) Lysat témoin Lysat XPC Lysat témoin pCPD p8oxoG pAlkB pCisP pAbaS pGlycol Léger effet de la concentration sur le niveau relatif d’ER du lysat nucléaire XPC pour les photoproduits, les adduits du cisplatine et la 8-oxoG Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

43 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats: Effet de la concentration protéique CONCLUSIONS EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE Rappel: avec peu de protéine, XPA = Témoin Niveau basal + beaucoup de protéines Meilleure efficacité des activités NER et de réparation de la 8-oxoG Peu d’effet de la concentration sur le profil relatif de XPC Effet de la concentration sur le profil relatif de XPA Meilleure discrimination des phénotypes XP à fortes concentrations protéiques A 1 mg/mL, niveaux de réparation les plus faibles pour les lésions prises en charge par la NER et la 8-oxoG Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

44 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Résultats DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (1) Nos tests in vitro d’excision-resynthèse et d’excision permettent d’appréhender la réparation de l’ADN comme un réseau enzymatique dynamique et complexe Le niveau basal avec la concentration standard est à considérer: il apporte de nouvelles informations quant aux régulations et mécanismes mis en jeu à de telles concentrations protéiques. Que se passe-t-il in vivo? Les niveaux de réparation obtenus pour XPA et XPC sont supérieurs à ceux de la littérature obtenus avec d’autres méthodes de mesure in vivo (Athas et al., 1991; Cleaver 2005) et in vitro (Masutani et al., 1993) Athas = HCR XPA entre 5,6 et 12,1 % de l’activité du témoin Cleaver= UDS XPA entre 2 et 5% de l’activité du témoin Les ratios Protéines / ADN ou Protéines / Lésions sont des paramètres à prendre en considération lors des tests in vitro Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

45 ? DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (2)
Stimulation de la réparation en réponse aux UVB Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG à forte concentration 1. Niveau basal + concentration protéique standard Activités NER limitantes? A quoi est dû le niveau basal? Discrimination difficile 2. Irradiation UVB 3. Augmentation de la concentration protéique Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG: Implication des facteurs XP dans la réaction d’ER Discrimination possible Athas = HCR XPA entre 5,6 et 12,1 % de l’activité du témoin Cleaver= UDS XPA entre 2 et 5% de l’activité du témoin Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

46 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
PLAN Introduction La réparation de l’ADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de l’ADN Objectifs Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype d’ER Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

47 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Conclusions et perspectives BILAN: TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA RÉPARATION DE L’ADN Athas = HCR XPA entre 5,6 et 12,1 % de l’activité du témoin Cleaver= UDS XPA entre 2 et 5% de l’activité du témoin Informations complémentaires Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

48 Meilleure discrimination des phénotypes XPA et XPC
Conclusions et perspectives APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (1) Niveau basal avec concentration protéique standard : faible discrimination des phénotypes XP DIAGNOSTIC ? Irradiation des cellules au préalable Augmentation de la concentration protéique Meilleure discrimination des phénotypes XPA et XPC Approfondir l’étude à tous les groupes de complémentation, de A à G Approfondir les phénotypes et arriver à déterminer une signature de la réparation de l’ADN pour chaque groupe XP pour pouvoir clairement les identifier Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

49 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Conclusions et perspectives APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (2) Tester des petites molécules: M1 [M1]= 0,1 mM [Lysat nucléaire]= 0,7 mg/mL M1 0 mM Profil de XPC très différent de XPA En utilisant des petites molécules, il serait possible de discriminer facilement les différents groupes de complémentation? Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

50 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Conclusions et perspectives PERSPECTIVES Fibroblastes primaires: Confirmer les résultats obtenus à partir des lignées Amélioration du test : nature des lésions (photoproduits: séparer les CPDs des 6-4 PPs) Comprendre la signification du niveau basal Approfondir l’effet de la concentration sur les activités de réparation (lysats totaux, autres groupes de complémentation) Rôle de XPA dans la réparation des dommages oxydatifs? Hypothèse: Relation avec les troubles neurologiques développés par ces patients Echantillon: arriver à travailler à partir d’un prélèvement sanguin? Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

51 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Remerciements Laboratoire FRE 29-39, IGR, Stabilité génétique et oncogenèse (Pr. Alain Sarasin) Sylvie Sauvaigo Zohra Termache Sylvain, Francette, Jocelyne, Gwenaëlle … Et tout le LAN Laboratoire CEA, Stabilité génétique et oncogenèse (Dr. Denis Biard) Laboratoire CEA, Plateforme cytométrie en flux, iRTSV (Véronique Collin-Faure, Serge Candéias) CEA, INSTN, Contrat de Formation par la Recherche MERCI! Florence Pivard et Sandrine Bessette, stagiaires ESTBB en 2007 et 2008 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

52 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009
Partie TITRE DE DIAPO Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009