Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette

Présentation au sujet: "Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette"— Transcription de la présentation:

1 Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs
Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette INSERM U366 - CEA Grenoble Sous la direction de Didier Job et Odile Valiron

2 Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire Objectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules Conclusions et perspectives

3 Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire Objectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules Conclusions et perspectives

4 Le cytosquelette microtubulaire
Interphase Mitose

5 Structure des microtubules

6 Assemblage des microtubules
Eléments requis : Concentration critique, température minimale Source d’énergie: GTP Solution adéquate (tampon, magnésium) L’assemblage est réversible, nécessite de l’énergie, atteint un état stationnaire hors d’équilibre

7 Nucléation des microtubules
Oligomères Feuillets DIMERES MICROTUBULES

8 Elongation des microtubules
Elongation de feuillets Addition de dimères

9 Etat stationnaire + - Consommation d’énergie à l’état stationnaire
Flux de sous-unités Treadmilling + - Instabilité dynamique 2000 10 50 4000 30 Longueur (µm) Temps (s)

10 Dynamique des microtubules in vivo
Interphase Mitose Une architecture dynamique Modifications du réseau au cours du cycle cellulaire Renouvellement permanent des microtubules Instabilité dynamique « tempérée » Treadmilling

11 Contrôle de la stabilité des microtubules
Protéines stabilisant les microtubules MAP1, MAP2, Tau, E-MAP115, MAP 4 Lis1, Doublecortine XMAP230, XMAP215, TOGp STOP Intégrateurs du cytosquelette Plakines, BPAG1 (microtubules, neurofilaments) MACF (microtubules, actine) Protéines déstabilisantes Stathmine, SCG10 XKCM1, Kar3p Rev

12 Modulation du turnover des microtubules
Protéines liant l’extrémité plus des microtubules Bim1, EB1, EB2 Tip1p

13 Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire Objectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules Conclusions et perspectives

14 Objectifs Réévaluation des facteurs contrôlant la dynamique des microtubules Obtention et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules Recherche de nouveaux effecteurs de la dynamique des microtubules

15 Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire Objectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules Conclusions et perspectives

16 Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules
Mise au point de dosages  Mesure simultanée de - concentration en tubuline-GTP - « masse » de tubuline assemblée - distribution de longueurs des microtubules et longueur moyenne  [Tubuline-GTP](t)  m(t)  l(t)  [MT](t) Tubuline complexée au GTP sans excès de GTP Pas de système régénérateur du GTP  la tubuline n’assemble qu’une seule fois

17 Réactions d’assemblages
Vitesse et amplitude augmentent Symétrie des courbes Désassemblage en dessous de la concentration critique

18 Nucléation des microtubules
Vitesse de formation de nouveaux microtubules : Indépendante de la concentration instantanée en Tubuline-GTP Fortement dépendante de la concentration initiale en Tubuline-GTP Exposant de nucléation : environ 6,2

19 Elongation des microtubules
Vitesse d’élongation indépendante de : - concentration instantanée de tubuline-GTP - concentration initiale en tubuline-GTP  Limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules ?

20 Désassemblage des microtubules
Des facteurs de catastrophes  des oligomères ? Désassemblage par catastrophes Indépendant de la longueur

21 Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules
Nucléation : un intermédiaire stable entre les dimères de tubuline et les microtubules  Des oligomères de tubuline ? Elongation limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules  Fermeture de feuillets Désassemblage limité par la fréquence de catastrophe  Des oligomères facteurs de catastrophes ?

22 Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire Objectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules Conclusions et perspectives

23 Recherche d’oligomères de tubuline contrôlant la nucléation des microtubules
Production d’assemblages de tubuline stabilisés par pontage covalent Protocole dérivé de méthodes de production « d’amorces » de microtubules : pontage modéré Assemblage de microtubules puis traitement modéré à l ’EGS Collecte des fragments de microtubules stabilisés Filtration éliminant les particules de plus de 100 nm

24 Caractérisation des solutions d’oligomères de tubuline
Les solutions d’oligomères stimulent l’assemblage des microtubules sous la concentration critique Absence de fragments de microtubules dans les solutions - filtration 100 nm - observation en immunofluorescence

25 Caractérisation des solutions d’oligomères
Diffusion de lumière Microscopie électronique Uniquement des dimères (env. 8 nm) et des oligomères (env. 42 nm) Des oligomères linéaires

26 Structure des oligomères
Liaison de GTP par le dimère de tubuline  échangeable sur la sous-unité b Structures possibles des oligomères Association latérale Association longitudinale Feuillet

27 Propriétés de liaison du GTP par les oligomères
Echange du GTP des oligomères contre du GTP radioactif  Des oligomères formés par association latérale de dimères Affinité plus faible Echange plus lent  contraintes liées au pontage ?

28 Mécanisme de nucléation des microtubules par les oligomères
Tubuline assemblée Longueur moyenne des microtubules Concentration en microtubules  Exposant de nucléation

29 Exposant de nucléation
 Environ 4 oligomères sont nécessaires pour former un nouveau microtubule

30 Caractérisation d’un intermédiaire de nucléation
Des oligomères linéaires formés par association latérale de dimères 42 nm  environ 10 dimères Taille + diffusion dynamique de la lumière  65% de tubuline sous forme oligomérique Exposant de nucléation : environ 4 4 oligomères se combinent pour former un microtubule  formation d’un feuillet ? Les microtubules ne désassemblent pas spontanément Absence de facteurs de catastrophes ?

31 Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire Objectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules Conclusions et perspectives

32 Stratégie de recherche de partenaires de la tubuline

33 Partenaires de la tubuline
Un nombre limité de partenaires Des partenaires variables selon la nature des extraits

34 Protéines identifiées
MAPs et moteurs MAP2, KIF21A Protéines de la famille EB EB1, EB2 HSPs HSP70, HSP90 Enzymes du métabolisme Citrate lyase

35 Efficacité de la méthode
Identification de protéines liées au cytosquelette microtubulaire Identification toujours en cours Utilisation d’extraits cellulaires humains (séquençage achevé) Grande diversité d’extraits cellulaires possibles Purification de partenaires interférant avec l ’assemblage Exposition des domaines de la tubuline impliqués dans l’assemblage Possibilité de tests fonctionnels en sortie de colonne Identification d’effecteurs de la nucléation, de facteurs de catastrophes

36 Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire Objectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules Conclusions et perspectives

37 Conclusions Facteurs contrôlant l’assemblage des microtubules
Nucléation en deux étapes (oligomères ?) Elongation limitée par les propriétés structurales des microtubules Désassemblage limité par la fréquence de catastrophes Facteurs de catastrophes = oligomères? Stabilisation et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules Stabilisation de fragments de microtubules par pontage covalent modéré Oligomères formés par association latérale d’environ 10 dimères Environ 4 oligomères nécessaires pour former un microtubule Identification de partenaires de la tubuline Des partenaires identifiés « qui font sens » Identifications en cours

38 Perspectives Transposition aux études cellulaires
Des outils pour étudier les effecteurs du cytosquelette Mesure de l’activité sur la nucléation, l’élongation, le désassemblage Etude détaillée de la nucléation à partir des oligomères Recherche de facteurs de catastrophes Réalisation d’un  « protéome » des partenaires de la tubuline Transposition aux études cellulaires Effet des oligomères de nucléation dans les cellules