Interactions des protéines GRA avec des vésicules unilamellaires

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1 Interactions des protéines GRA avec des vésicules unilamellaires
Développement de systèmes membranaires modèles pour la vacuole parasitophore de Toxoplasma gondii : Interactions des protéines GRA avec des vésicules unilamellaires Thèse de Doctorat en Physique soutenue par Pauline RUFFIOT Sous la direction de Marie-France CESBRON-DELAUW et Antoine DELON

2 Contexte biologique: T. gondii
Toxoplasma gondii est un protozoaire eucaryote, appartenant au phylum des Apicomplexa: c’est un parasite intracellulaire obligatoire. Hôtes définitifs: Félidés Mérozoïte Sporozoïte Bradyzoïte Tachyzoïte Hôtes intermédiaires: Mammifères et oiseaux Environnement Forme proliférative Forme dormante Reproduction sexuée Pathogène responsable de la toxoplasmose: 50% de la population mondiale infectée; Formes graves chez les fœtus et les sujets immunodéprimés. Proche de Plasmodium falciparum, responsable de la malaria Réactivation chez les sujets immunodéprimés Transmission verticale au foetus Toxoplasmose congénitale Encéphalite

3 La vacuole parasitophore (VP) de T. gondii
Un compartiment spécialisé au sein de la cellule-hôte, formé activement par le parasite Sécrétion des micronèmes 1. Attachement Sécrétion des rhoptries 2. Invasion Sécrétion des granules denses 3. Maturation de la VP 4. Prolifération des parasites [Lebrun et al.,2007] 1µm

4 Les systèmes membranaires de la VP
Parasite PVM PV Cellule-hôte [Coppens et al., 2006] [Magno et al., 2005a] HOSTs: Tubules séquestrant des organites de la cellule-hôte PVM: Membrane délimitant la VP RNM: Réseau de nanotubes membranaires Tubules de diamètre ~50nm sous-tendus par un microtubule de la cellule-hôte Tubules de diamètre 30-50nm

5 La famille des protéines GRA
Protéines de granules denses Hélice amphipathique GRA1 GRA2 GRA3 GRA4 GRA5 GRA6 GRA7 GRA8 GRA9 Domaine transmembranaire La plupart des protéines GRA contiennent un segment hydrophobe ou amphipathique, susceptibles d’interagir avec des membranes.

6 Trafic post-sécrétoire des protéines GRA
Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole Associées aux structures membranaires de la vacuole mature

7 Trafic post-sécrétoire des protéines GRA
Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole Associées aux structures membranaires de la vacuole mature

8 Trafic post-sécrétoire des protéines GRA
Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole Associées aux structures membranaires de la vacuole mature RNM GRA2,4,6,9 Toutes GRA Lumen PVM GRA3,5,7 HOSTs GRA7

9 Trafic post-sécrétoire des protéines GRA
Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole Associées aux structures membranaires de la PV mature HOSTs RNM GRA7 Lumen PVM GRA2,4,6,9 Toutes GRA GRA3,5,7 Bien que contenant pour la plupart des domaines hydrophobes, les protéines GRA existent en partie sous des formes solubles tout au long de leur trafic post-sécrétoire. Partiellement solubles Essentiellement solubles Fraction luminale soluble

10 Interactions des protéines avec les membranes de la VP
Rôle de GRA2 et GRA6 dans la formation du RNM [Mercier et al., 2002] RNM En parasite sauvage: Tubules homogènes En l’absence de GRA2: Matériel granulaire, non structuré En l’absence de GRA6: Vésicules GRA2 et GRA6 sont nécessaires à la mise en place du RNM [Coppens et al., 2006] Rôle de GRA7 dans la formation des HOSTs ? HOST GRA7 participe à un manteau cylindrique formé autour des membranes des HOSTs

11 Problématiques abordées
Trafic post-sécrétoire Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant d’atteindre leurs membranes-cibles ? Association membranaire Quels sont les paramètres nécessaires pour l’association des protéines GRA aux membranes de la vacuole ? Formation de tubules membranaires De quelle manière les protéines sont-elles impliquées dans la formation du RNM et des HOSTs?

12 Stratégie: Un modèle pour la VP Protéines GRA Membranes modèles
Physique des vésicules géantes (LSP) Etude de la VP (LAPM) Exploration des interactions membranaires et des fonctions des protéines GRA Protéines GRA + Modèle de la VP Membranes modèles Microscopie de fluorescence (LSP) Biochimie (LAPM)

13 Contraintes du système
Pas de protéines GRA purifiées -> Travail à partir de: 3 fractions ultrasolubles riches en protéines des anticorps spécifiques de chacune des protéines GRA. Milieu de culture complémenté de serum de veau foetal Protéines de parasites extracellulaires Protéines sécrétées in vitro Protéines de cellules infectées Formes solubles obtenues par ultracentrifugation ( g; 1h)

14 rencontrées dans la vacuole.
Membranes-modèles Lipides HeLa Les SUVs et GUVs ont été formées à partir d’un extrait lipidique total de cellules HeLa (cellules humaines), afin d’approcher la composition lipidique des membranes rencontrées dans la vacuole.

15 Présentation des résultats
Microscopie de fluorescence (LSP) Biochimie (LAPM) Travail sur SUVs En solution Travail sur GUVs Formes de solubilisation Association membranaire Déformations membranaires Comparaison des différentes formes ultrasolubles des protéines GRA Association spontanée Répartition des protéines GRA Implication des protéines GRA dans des déformations membranaires? Association spontanée

16 2 hélices amphipathiques
Protéines GRA suivies GRA1 Contrôle: hydrophile GRA2 2 hélices amphipathiques RNM GRA6 1 TMD GRA3 PVM 1 TMD PVM + HOSTs GRA7 1 TMD HOSTs RNM GRA7 Lumen PVM GRA2,4,6,9 Ttes GRA GRA3,5,7

17 Biochimie Analyse des formes solubles des protéines GRA par séparation isopycnique Détermination des capacités d’association des protéines GRA avec des SUVs

18 Analyse des formes solubles des protéines GRA
Séparation isopycnique Protéines à analyser d=1.01 Gradient linéaire de glycérol d=1.13 Centrifugation jusqu’à l’équilibre ( g; 17h) Chaque protéine sédimente jusqu’à une densité isopycnique spécifique. Détection des protéines GRA par immunoblot à l’aide d’anticorps spécifiques Bottom Top 1 2 3

19 Analyse des protéines sécrétées in vitro
GRA1 GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 1.01 1.02 1.03 1.04 1.05 1.06 1.07 1.12 1.10 1.11 Signature des protéines sécrétées in vitro

20 Analyse des protéines GRA des différentes fractions
Prot. parasite GRA1 Prot. sécrétées Soluble Prot. cell. infectée GRA2 ? GRA3 Protéines à domaines Transmembranaires: Formes plus agrégées dans le parasite GRA6 GRA7 Signatures des fractions de protéines: références pour les expériences d’association membranaire

21 Association membranaire
Protéines sécrétées in vitro + SUVs HeLa SUVs + Protéines Agitation douce 1h, 20°C Séparation isopycnique SUVs

22 Les protéines GRA s’associent aux membranes HeLa
Prot. parasite GRA1 Prot. sécrétées Prot. cell. infectée GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 Les protéines GRA2,3,6,7, quelles qu soient leurs formes de solubilisation, sont capables de s’associer aux membranes HeLa

23 L’association de GRA2 et GRA6 aux SUVs dépend de leur composition
SUVs EPC + Protéines SUVs HeLa + Protéines Partenaires lipidiques de GRA2 -> GRA2 lie les phosphoinositides Incubation 1h, 20°C Ultracentrifugation différentielle ( g, 1h) P S P S Les protéines GRA2 et GRA6 sont capables de s’associer aux SUVs HeLa, mais pas aux SUVs EPC. -> Interactions spécifiques avec certains lipides? * EPC: phosphatidylcholine d’œuf * HeLa: extrait lipidique total de cellules HeLa

24 Validation du système-modèle
Les protéines GRA sécrétées contenant des séquences hydrophobes ou amphipathiques sont capables de s’associer spontanément à des membranes. Associées: GRA2, GRA3, GRA7 GRA6 SUVs HeLa Solubles: GRA1

25 Microscopie de fluorescence
Détection des protéines GRA par ImmunoFluorescence indirecte

26 Mode opératoire Formation des GUVs Association des protéines aux GUVs
Electroformation Incubation protéines 1h, t° amb Lavage GUVs HeLa Marquage des protéines par immunofluorescence Réalisation d’une chambre d’électroformation à flux: Incubation AC primaire Incubation AC secondaire Lavage Lavage

27 Les protéines GRA s’associent aux GUVs HeLa
25µm 25µm 25µm GRA3 25µm GRA2,6,7 se rassemblent en microdomaines protéiques à la surface. GRA3 est répartie de manière beaucoup plus diffuse, bien que non homogène.

28 Observation de GUVs groupées
GRA2 GRA7 25µm GRA3 25µm GRA6 GRA2 et GRA7 sont particulièrement concentrées aux zones de contact entre GUVs -> Rôle dans jonctions membranaires?

29 Les protéines GRA2 et GRA7 s’associent à des fils membranaires
GRA2 et GRA7 sont associées à des fils membranaires. -> Rôle dans leur formation?

30 Bilan Membranes des GUVs: GRA3 Micro-domaines protéiques: GRA2,GRA6,GRA7 Fils membranaires: GRA2 GUVs HeLa Réseau de fils ponctués: GRA7 Zones de contact: GRA2, GRA7 GRA2 et GRA7 présentent des caractéristiques particulières: elles sont concentrées aux zones de contact entre GUVs et présentes sur des fils membranaires.

31 Discussion des résultats
Trafic post-sécrétoire des protéines GRA Ciblage des protéines GRA aux membranes de la vacuole Rôles des protéines GRA dans la formation des HOSTs et du RNM

32 en gradient de glycérol
Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant d’atteindre leurs membranes-cibles? 1.07 1.01 1.03 1.05 1.02 1.04 1.06 Protéines ultrasolubles parasitaires sécrétées in vitro de cellules infectées Densité isopycnique en gradient de glycérol GRA1 GRA3 GRA6 GRA7 GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 GRA6 GRA3 GRA7

33 en gradient de glycérol
Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant d’atteindre leurs membranes-cibles? 1.07 1.01 1.03 1.05 1.02 1.04 1.06 Protéines ultrasolubles parasitaires sécrétées in vitro de cellules infectées Densité isopycnique en gradient de glycérol GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 GRA1 Formes plus agrégées transitoires plus solubles GRA2 Identification des protéines partenaires des protéines à domaine transmembranaire (GRA3,6,7) -> Braun et al., 2007

34 Paramètre suffisants: (in vitro)
Quels sont les paramètres nécessaires pour l’association des protéines GRA à des membranes ? Associées: GRA2, GRA3, GRA7 GRA6 SUVs HeLa Paramètre suffisants: (in vitro) Fractions solubles De parasite Sécrétée De cellule infectée SUVs HeLa + Paramètres nécessaires: Mécanisme de ciblage aux membranes de la vacuole Interactions spécifiques protéine-lipide ?

35 De quelle manière les protéines GRA sont-elles impliquées dans la formation du RNM et des HOSTs?
Fusion de petites vésicules Rôle de GRA2? Courbure spontanée locale - hél. amphipathique GRA2, - épingle TM GRA6 Stabilisation de la courbure Formation des HOSTs: Poussée des microtubules de la cellule-hôte Initiation de la déformation Stabilisation de la courbure Charpentage par GRA7 Protéine vacuolaire ?

36 Bilan Très récemment au LAPM, GRA2 a pu être purifiée.
Mise en œuvre de méthodes permettant l’analyse des protéines GRA sous forme solubles Validation du système-modèle: Les protéines GRA, sous forme soluble, sont capables de s’associer spontanément à des membranes (SUVs ou GUVs) de composition lipidique adaptée. Développement d’une méthode pour le marquage par immunofluorescence sur GUVs: Détection des protéines GRA associées aux GUVs. -> Possibilité d’application de techniques de spectroscopie de fluorescence GRA2 suffit à déformer des SUVs en tubules! [Travail de Amina Bittame, Stage M2 2007] SUVs HeLa + GRA2 + GTP

37 Remerciements Marie-France Cesbron-Delauw et Antoine Delon qui ont dirigé ma thèse, Patricia Bassereau et Jean-François Dubremetz qui m’ont fait l’honneur d’être rapporteurs de ma thèse, Annie Viallat qui a accepté de participer au jury de soutenance en tant qu’examinatrice, Bertrand Fourcade qui a accepté de présider ce jury, Toutes les personnes avec qui j’ai eu l’occasion de travailler et qui m’ont apporté leur aide, au LSP et au LAPM, mais également au Laboratoire de Génétique Moléculaire des Plantes, Et particulièrement Corinne Mercier, qui m’a suivie tout au long de mon travail de thèse.

38 Ouvertures: Etudes in vitro à partir de protéines GRA purifiées
En solution Etude des cinétiques d’association des protéines GRA En membrane Etude des associations protéiques au sein de la membrane Spectroscopie de fluorescence Dichroïsme circulaire Biochimie (FCS) (FCS, FRET) Etude des changements de conformation Identification des protéines partenaires Mode d’association membranaire *FCS: Spectroscopie à corrélation de fluorescence