Laurence Martel 19 décembre 2002

Présentation au sujet: "Laurence Martel 19 décembre 2002"— Transcription de la présentation:

1 Laurence Martel 19 décembre 2002
Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et Propriétés d’Architectures Moléculaires

2 Plan de l’exposé Contexte : relations structure/fonction des protéines
Méthodes d’analyse de surface Élaboration de monocouches de protéines Techniques d’étude expérimentale Réflectivité X Ellipsométrie Modélisation des courbes expérimentales Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire Présentation des cadhérines Rôle du calcium Interaction entre fragments Conclusions et perspectives

3 Relations structure/fonction des protéines
Structure cristallographique de protéines obtenues à partir de Cristaux 3D par Rayons X résolution atomique (jusqu’à 0,1 nm) Reconstruction 3D de la structure Enveloppe de la protéine Sticholysine II : résolution 1,5 nm (Martin-Benito et al. 2000) 1,2nm C-Cadhérine : résolution 0,308 nm (T. Boggon et al. 2002) Positions des atomes Cristaux 2D par microscopie électronique à transmission ou AFM résolution ~ 1 nm Hypothèses sur la fonction de la protéine Formation de complexes de protéines Immobilisation des protéines sur une surface Informations sur les interactions entre protéines Objectifs de cette étude Développer une méthodologie pour étudier les interactions entre protéines immobilisées et protéines en solution

4 Plan de l’exposé Contexte : relations structure/fonction des protéines
Méthodes d’analyse de surface Élaboration de monocouches de protéines Techniques d’étude expérimentale Réflectivité X Ellipsométrie Modélisation des courbes expérimentales Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire Présentation des cadhérines Rôle du calcium Interaction entre fragments Conclusions et perspectives

5 Élaboration de couches de protéines
1ère Étape : Formation d’une monocouche de lipides à la surface de l’eau Dépôt de lipides ligands chélatant un ion Ni2+ : Ni-NTA-DLGE + Lipides diluants pour la fluidité de la monocouche lipides diluants lipides ligands dire NTA nitrilotriacetate et on appelle DLGE... les lipides

6 Élaboration de couches de protéines
2ème Étape : Injection de protéines Ancrage par liaison de coordination histidine-nickel Exemple: Injection de cadhérines-His6

7 Élaboration de couches de protéines
3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase Étude des interactions entre protéines Exemple: Injection de fragments

8 Élaboration de couches de protéines
3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase Étude des interactions entre protéines

9 Techniques d’étude expérimentale
Informations recherchées Mesurer la quantité de protéines ancrées aux lipides Sans marqueur Sans transfert de la couche de protéines Suivi de l’évolution en temps réel et in situ Ellipsométrie à la surface de l’eau Résolution 0,5 mg/m2 = 0,5 ng/mm2 Résonance des plasmons de surface sur surface solide Déterminer la structure verticale de la couche Réflectivité des rayons X Résolution verticale 1 nm

10 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
Ligne de lumière Troïka II, ESRF (Responsable O. Konovalov) Goniomètre Cellule échantillon Faisceau synchrotron monochromatique

11 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
Mesure de l’intensité réfléchie spéculaire Réflectivité I/I0 Cas d’une interface simple : Air-Eau  qz-4

12 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
Réflectivité I/I0 Cas d’une couche sur un substrat : Lipides sur eau

13 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
Cas d’une couche complexe sur un substrat : Protéines ancrées aux lipides sur eau Monocouche de fragments de C-cadhérine Lipides ligands Ni-NTA-DLGE Courbe de réflectivité complexe Avantage de l’ESRF : la brillance du faisceau synchrotron permet de mesurer jusqu ’à des vecteurs de diffusion q~0,5 Å-1 soit une résolution de ~6,5 Å Nécessité d’une méthode d’analyse des données avec un modèle du système étudié

14 2. Ellipsométrie Mesure du rapport des coefficients de réflexion des polarisations p et s de la lumière autour de l’angle de Brewster Cas des lipides sur l'eau Indice eau n=1.333 Paramètres des lipides : n= d=2,5 nm Relation entre la mesure et l’indice de réfraction Suivi des variations des angles ellipsométriques  et  en fonction du temps, de , de 

15 Mesures angulaires après 2h, puis après 17h30
2. Ellipsométrie Suivi de l’adsorption de C-cadhérine à une monocouche de lipides ligands Ni-NTA-DLGE [Ca2+] = 0,5 mM Mesures angulaires après 2h, puis après 17h30 17h30 17h30 2h 2h Problème soulevé pour une couche épaisse (>10nm) Déplacement de la courbe ellipsométrique angulaire vers les grands angles Conséquences Non-linéarité de la variation de  et de  avec l’adsorption à angle fixe Interprétation des mesures cinétiques ?

16 Modélisation du système lipides+protéines
Objectif : Comparer les données expérimentales avec une courbe théorique pour déduire les paramètres (, d) caractérisant le système Système à N couches (, d)N Équations de Fresnel Simulation des courbes par un calcul matriciel d’Abélès Programmes de calcul : Réflectivité X : Parratt32 (HMI Berlin), R. Ober Paramètres ajustables : densité électronique , épaisseur d, rugosité  Ellipsométrie (et Résonance de Plasmon de Surface) : ce travail Paramètres ajustables : indice de réfraction n, épaisseur d

17 Réflectivité des rayons X en incidence rasante
Modèle de profil de densité électronique des lipides 2 couches : 7 paramètres d'ajustement (,d,) Réflectivité I/I0 Air Eau Chaîne carbonée Tête polaire et groupement Ni-NTA

18 Réflectivité des rayons X en incidence rasante
Modèle de profil de densité électronique d’une monocouche de fragments de C-cadhérine 30 couches : d=0,7 nm, =0 nm  30 paramètres d'ajustement ()N

19 Comparaison ellipsomètrie et réflectivité X : masse adsorbée par unité de surface
Réflectivité X : Aire sous le profil de densité électronique, lipides soustraits <P> ~ 0,417 e.Å-3 : densité électronique moyenne de la protéine Rem rapport masse / électron dans la protéine sèche Ellipsométrie : Approximation de De Feijter et al. (1978) dn/dc ~ 0,19 cm3/g : incrément d’indice de la solution de protéine Masse de C-cadhérine adsorbée aux lipides Ellipsométrie [Ca2+] = 0,5 mM Réflectivité X [Ca2+] = 5 mM Après 2h : 6,0 ± 0,5 mg/m2 Après 4h : 8,1 mg/m2 Après 17h30 : 8,7 ± 0,5 mg/m2

20 Résultats Mises au point
Technique d’élaboration de monocouches de protéines Techniques expérimentales d’analyse de surface complémentaires Modélisation du système en multicouches Ellipsométrie Mesure des angles ellipsométriques  et  Ajustement pour obtenir <n> et <h> Estimation de la masse adsorbée apparente de protéines ancrées aux lipides Mesures cinétiques : 1 point / 3 secondes Réflectivité des rayons X Mesure de l’intensité réfléchie Ajustement pour obtenir le profil de densité électronique perpendiculaire à la surface Calcul de la masse de protéines adsorbée aux lipides Application à l’étude des interactions entre protéines d’adhérence cellulaire

21 Plan de l’exposé Contexte : relations structure/fonction des protéines
Méthodes d’analyse de surface Élaboration de monocouches de protéines Techniques d’étude expérimentale Réflectivité X Ellipsométrie Modélisation des courbes expérimentales Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire Présentation des cadhérines Rôle du calcium Interaction entre fragments Conclusions et perspectives

22 Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérence
Exemple des cellules de l’endothélium vasculaire Plusieurs familles de Protéines d’Adhérence Cellulaire

23 Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérence
Famille des cadhérines Glycoprotéines transmembranaires Sur tous types de cellules Différentes cadhérines selon les cellules : VE-cadhérine humaine (Vascular Endothelium) C-cadhérine de Xenopus 5 domaines extracellulaires homologues (EC) 12 ions Ca2+/cadhérine pour un bon repliement ~23nm

24 Interaction entre molécules d ’adhérence
Interactions entre domaines extracellulaires de cadhérine parallèles et anti-parallèles Concentrations critiques en calcium Perz et al. 1999 mM [Ca2+] 0,05 0,5 1 pas d’interaction dénaturation cis trans

25 Problématique : interaction entre cadhérines?
Quelle loi d’assemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ? Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ? Modèles actuels d’après résolutions de structure 3D et études en solution E- et N-cadhérine : Interaction trans par domaines N-terminaux C-cadhérine : Interactions trans selon 3 alignements (mesures de force de surface)

26 Problématique : interaction entre cadhérines?
Quelle loi d’assemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ? Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ? Modèles actuels d’après résolutions de structure 3D et études en solution VE-cadhérine : Formation d’hexamères du fragment VE-EC1-4 modèle d’interaction trans

27 Les protéines recombinantes étudiées
Parties extracellulaires seulement C-cadhérine Collaboration Deborah Leckband - UIUC, Urbana Fragment principal : C-EC1-5 His VE-cadhérine Collaboration Danielle Gulino - IBS, Grenoble Fragment principal : VE-EC1-4 His ~19 nm ~23 nm

28 Objectif de l’étude des cadhérines
Questions posées Structure et alignement cis ou trans le long des complexes de C-cadhérine? le long des hexamères de VE-cadhérine? Approche expérimentale Caractérisation de couches de cadhérines par ellipsométrie : masse adsorbée par réflectivité X : structure verticale 1) Variation de la concentration en calcium Suivi de la masse adsorbée Évolution de la structure des couches 2) Interactions entre fragments de différentes longueurs

29 Monocouche de C-cadhérine en présence de calcium
Monocouche de fragments C-EC1-5His avec [Ca2+] = 5 mM Lipides ligands Ni-NTA-DLGE Après 4 heures d’incubation Épaisseur totale ~16 nm Modèle d’interactions des cadhérines dans la couche Complexes cis ou trans ? D’après la structure de T. Boggon et al. (2002) Inclinaison moyenne de 50° / surface

30 Influence de la concentration en calcium sur une couche de cadhérines
Cadhérine sensible aux variations de la concentration calcium ? [Ca2+] > 1 mM Pas de variation attendue - calcium [Ca2+] < 0,5 mM Monomères ou complexes cis Perte de masse due à Décrochement de cadhérines Dissociation des complexes Complexes trans

31 Dissociation de complexes de C-cadhérine
Influence de l’agent chélatant d’ions divalents EGTA sur une monocouche de C-cadhérine Ellipsométrie : Suivi cinétique de  et  Masse apparente de protéine adsorbée [Ca2+] =10mM [EGTA]=10mM [Ca2+] =5mM -5% -17% 6,7 mg/m2 5,8 mg/m2 7,0 mg/m2 C B A Perte de masse après l’ajout d’EGTA La masse initiale de C-cadhérine est retrouvée à 95% par simple ajout de calcium 34% des fragments en complexes trans A B C

32 Dissociation de complexes de C-cadhérine
À partir d’une couche élaborée sur forte concentration en calcium Dilution de la sous-phase Réflectivité X Profils de densité électronique Perte de masse après dilution 30% de fragments en complexes trans -15% 6,4 mg/m2 7,5 mg/m2 Conclusion Pertes de masse et déstructuration des couches de C-cadhérines

33 Conclusion sur la C-cadhérine
Cadhérines immobilisées sensibles au calcium Cadhérines inter-digitées dans la monocouche Dissociation de complexes trans de C-cadhérines [Ca2+] = 1 mM [Ca2+] = 0,1 mM Mais … Les fragments possèdent tous une étiquette histidine

34 Interactions entre fragments de VE-cadhérine
Localisation des interactions entre cadhérine le long de la protéine ? Interactions établies en solution entre fragments identiques de VE-cadhérine (S. Bibert et al. 2002) Trois mélanges de fragments VE-EC1-4 et de fragments courts Rapport 1:100 (EC1-4:court) pour favoriser la formation de complexes mixtes en solution

35 Interactions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 seul His6

36 Interactions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 seul His6 ~19 nm ~23,3 nm Épaisseur totale ~ 21 nm Hexamères en surface ?

37 Interactions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment fragment 1-3 His6

38 Interactions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment fragment 1-3 His6 Profil de densité électronique similaire au cas du fragment 1-4 seul

39 Interactions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment fragment 2- 4 His6

40 Interactions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment fragment 2- 4 His6 Fragment 1-4 +fragment 1-3 Profil similaire à celui des lipides Pas d'interaction lipide-cadhérine

41 Interactions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment fragment 3-4 His6

42 Interactions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment fragment 3-4 His6 Fragment 1-4 +fragment 1-3 Fragment 1-4 +fragment 2-4 Profil similaire à celui des lipides Pas d'interaction lipide-cadhérine

43 Conclusion sur la VE-cadhérine
Modèles d’interaction entre cadhérines Ancrage de protéines aux lipides dans le cas du mélange EC1-4/EC1-3 Pas d’ancrage de protéines aux lipides dans le cas des mélanges EC1-4/EC2-4 et EC1-4/EC3-4 Entre fragments de longueurs différentes Dans l’hexamère ? Importance du domaine EC4 La formation de complexes bloque l’étiquette histidine

44 Conclusion sur la VE-cadhérine
Modèles d’interaction entre cadhérines En plusieurs étapes ? Formation de complexes cis puis de complexes trans Mélange de complexes en surface ?

45 Conclusions Sur l’étude des cadhérines
Dissociation de complexes et déstructuration de la monocouche de C-cadhérine par appauvrissement de la sous-phase en calcium Il existe des complexes anti-parallèles totalement enchevêtrés en surface Importance du domaine EC4 dans les interactions entre fragments de VE-cadhérine Hexamères en surface ? Sur la méthodologie développée Ellipsométrie Nécessaire prise en compte de la non-linéarité de  et de  avec l’adsorption (mesures à angle fixe) Estimation quantité de matière adsorbée en surface, Résolution 0,5 mg/m2 Suivi de la quantité de matière adsorbée en temps réel Réflectivité des rayons X Des profils de densité électronique complexes rendent compte de changements fins dans la couche de protéines Résolution ~ 1 nm (suivant la normale à la couche)

46 Perspectives Étude des Cadhérines Modélisation de la Réflectivité X
Étude des interactions entre cadhérines immobilisées avec Un plus grand nombre de fragments courts différents Fragments sans étiquette histidine Structure de complexes cristallisés à 2 dimensions (VE-cadhérine : thèse R. Al-Kurdi) Questions ouvertes Observations de différences d’affinités en surface et en volume Faible action de l’agent chélatant EGTA sur le nickel des lipides ligands ? Modélisation de la Réflectivité X Améliorer la modélisation en tenant compte de Couches d’épaisseurs variables Conservation du nombre d’électrons dans une couche Monocouche de protéines sur Surfaces Solides Manipulation des échantillons facilitée Étude par Résonance de Plasmons de Surface et Réflectivité de rayons X durs

47 Perspectives Appareil de mesure de la Résonance de Plasmons de Surface