Techniques d’étude et d’analyse des protéines: 1- introduction

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1 Techniques d’étude et d’analyse des protéines: 1- introduction
Les techniques d’étude et d’analyse d’une protéine nécessite d’abords son extraction et sa purification. Ceci peut donc apparaître comme un problème difficile pour 2 raisons : Elle n’existe qu’à très faible concentration Elle est mélangée à des millier d’autres protéines Malgré cela les protéines peuvent être isolées et ceci pour 2 raisons: Les méthodes d’isolement couvrent toutes les propriétés que peuvent avoir les protéines en solution (propriétés différentes due à l’expression de gènes différents) Le pouvoir de résolution des techniques de séparations est très élevé (exemple focalisation isoélectrique)

2 2- Méthodes d’extraction et fractionnement des protéines
L’extraction requiert que l'on brise le matériel biologique en question pour en libérer les substances ou les structures désirées. Il s'agit d'une étape initiale à beaucoup de procédures expérimentales en biochimie et qui s'appelle l’homogénéisation. Celle-ci est obtenue par 2 types de traitements: Lyse: Lyse osmotique, lyse enzymatique, Détergents, solvants inorganiques Traitements mécaniques: Broyage, Mixeur, Homogéniseur, Sonicateur

3 2.1-Centrifugation homogénéisation
Après Traitements mécaniques ou lyse on obtiens : un Homogénat homogénéisation Centrifugation différentielle Centrifugation zonale

4 2.2- FILTRATION ET ULTRAFILTRATION
La filtration est fréquemment employée en biochimie pour un grand nombre d'applications : stérilisation, isolement de précipité, élimination de sels de solutions, concentration de macromolécules,

5 2.3- DIALYSE Il se produit souvent qu'une préparation de macromolécules contienne différents produits dont on veut se débarrasser. Ces produits, sels, glucides, détergents ou autres petites molécules, étaient présents dans la préparation initiale ou ont été introduits lors d'une étape de la purification. Une façon simple d'éliminer ces petites molécules est la dialyse La dialyse est basée sur les principes régissant la diffusion à travers une membrane perméable ou semi-perméable. Les ions se déplacent du milieu le + concentré vers le - concentré

6 3- Méthodes de purification et d’analyse des protéines
La purification d’une protéine se fait en +sieurs étapes en faisant intervenir à chaque étape une des propriétés que peut avoir cette protéine en solution Lors de ces différentes étapes le contrôle de l’efficacité de la purification s’impose pour réussir un isolement avec un rendement acceptable

7 Propriétés des protéines et Techniques de purification
Propriétés de base Techniques de séparation Taille et Densité Centrifugation, Dialyse, Filtration et ultrafiltration Chromatographie d’exclusion Electrophorèse sur gel de porosité  ou  Electrophorèse en SDS-page Solubilité, polarité Précipitation par différence de solubilité (PH, µ ) Chromatographie sur papier Chromatographie d’adsorption Charge Chromatographie échangeuse d’ion Electrophorèse Focalisation isoélectrique Spécificité Chromatographie d’affinité

8 Détection des composés séparés:
Détection par rayonnements radioactifs si le composé est radioactif. Par éclairage UV si la structure de la molécule permet l’absorption en lumière ultraviolette. Par pulvérisation d'une substance qui réagit avec le composé recherché pour donner une certaine couleur. Exemple: les acides aminés  réagissent avec la ninhydrine pour donner un composé violet foncé. Les amines secondaires, comme Pro, réagissent également avec ce composé mais pour donner une coloration jaune.

9 3-Techniques d’étude et d’analyse des protéines:
3.1-Précipitation par différence de solubilité (pH et µ) 3.2-Chromatographie 3.2.1-Chromatographie sur papier 3.2.2-Chromatographie d’adsorption 3.2.3-Chromatographie par échange d ’ions 3.2.4-Chromatographie par gel filtration (exclusion de taille) 3.2.5-Chromatographie par affinité 3.3-Électrophorèse 3.3.1-Électrophorèse sur papier 3.3.2-Electrophorèse non dénaturante sur gel de porosité  ou  3.3.3-Électrophorèse en SDS-page : 3.3.4-Électrophorèse sur gradient de pH (focalisation isoélectrique ou électrofocalisation) 3.4-Electrochromatographie (carte peptidique, empreinte digital ou finger print)

10 3.1- Précipitation par différence de solubilité
On provoque la précipitation de la protéine à isoler soit par précipitation isoélectrique ou par relargage Pour la première, on ajuste le pH d’une solution d’un mélange protéique au pHi de l’une d’entre elles, ainsi la totalité de cette protéines précipite laissant en solution les autres dont les pHi sont > ou < au pH choisi. Après centrifugation la totalité de cette protéine se trouve dans le culot

11 3.2-Chromatographie : 3.2.1-Chromatographie sur papier
3.2.2-Chromatographie d’adsorption 3.2.3-Chromatographie par échange d ’ions 3.2.4-Chromatographie par gel filtration (exclusion de taille) 3.2.5-Chromatographie par affinité

12 3.2.1-Chromatographie sur papier:
Solvant monte par capillarité Vit. de migration dépend de la solubilité dans la phase stationnaire polaire et la phase mobile non-polaire Les molécules se séparent selon leur caractère polaire. Les non polaires se déplacent plus vite que les polaires sur un support hydrophille coefficient de partage (Cp) : Cp = [dans la phase stationnaire] [dans la phase mobile]

13 3.2.1-Chromatographie sur papier:
La vitesse de migration d'un composé peut être définie par le rapport : Rf = Dist. parcourue par la substance Dist. parcourue par le front de solvant Chaque composé possède un Rf caractéristique pour un système de solvant donné et un type de support choisi.

14 3.4- Chromatographie bidimensionnelle

15 3.2.2-Chromatographie d’adsorption type HPLC
HPLC série 1100 Fait appel à des pressions élevées pour pousser le solvant dans la colonne Avantages: Grande résolution Vitesse de l'analyse  Grande reproductibilité Bon contrôle des paramètres Instrument et analyse informatisés

16 3.2.3- Chromatographie par échange d’ions:

17 3.2.3- Chromatographie par échange d’ions:
Les contres ions liés à un support insoluble sont remplacés de manière réversible par d’autres ions en solution avec lesquels ils ont plus d’affinité: R+C- + P-  R+P- + C- R+C- est un échangeur d'anions, et P- représente les anions en solutions. Les échangeurs de cations, portent des groupements chargés négatifs qui lient des cations de manière réversible. Les protéines, lampeuvent aussi bien se lier à des échangeurs de cations qu'à des échangeurs d'anions, selon la valeur de leur charge nette.

18 3.2.3- Chromatographie par échange d’ions:
Les composés qui n'interagissent pas avec l'échangeur d'ions ne sont pas retenus. Plus les composés interagissent avec l'échangeur d'ions, plus ils sont retenus par la colonne. Une fois que les composés non voulus sont élués de la colonne, ceux voulus peuvent être élués plus facilement en remplaçant le tampon d'élution par un autre de concentration saline supérieure et/ou de pH convenable.

19 3.2.3- Chromatographie par échange d’ions:
Les échangeurs d'ions sont des groupements chargés liés de façon covalente à une matrice-support (résine). L'échangeur d'anions cellulosique le plus utilisé est le (DEAE)-cellulose L'échangeur de cations cellulosique le plus utilisé est le (CM)-cellulose

20 3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration):

21 3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration):
Les billes sont composées de dextran (Séphadex), d'agarose (Sépharose) ou de polyacrylamide (Séphacryl). La taille des pores des billes est voisine des macromolécules à séparer.

22 3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration):
Ve est le volume nécessaire de phase mobile pour éluer un composé de la colonne après son dépôt sur le gel. V0 est déterminé par mesure du Ve d'un composé dont la masse moléculaire est supérieure à la limite d'exclusion du gel. Vt est déterminé par mesure du Ve d'un composé dont la masse moléculaire est inférieure à la limite d'exclusion du gel V0< Ve < Vt Plus la molécule est grosse, plus difficilement elle pénétrera dans les pores, elle sortira plus rapidement. Plus la molécule est petite, plus elle pourra occuper une plus grande portion du volume Vi, plus grand sera son Ve, plus elle sera ralentie et elle sortira plus tard.

23 3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration):
Si la molécule peut entrer dans les pores du gel, sa répartition entre la phase interne et la phase externe est donnée par le coefficient de distribution KD : KD= (Ve - V0 ) / (Vt – V0 ) = -a log MM + b Avec ≤ KD ≤ 1 Méthode utilisée également pour la détermination de la masse moléculaire des protéines

24 Ve en fonction de la MM de différentes protéines:
Sephadex G-200 (5-600 kDa) pH 7,5

25 3.2.5-Chromatographie par affinité:
Fait appelle aux fonctions biologiques des protéines. formation de liaisons ou de complexes avec de petites molécules biologiques spécifiques (ligands). liaison covalente du ligand sur un support insoluble comme la cellulose ou l'acrylamide. la protéine recherchée ayant une affinité pour le ligand se fixera à ce dernier et sera immobilisée. Lavage pour enlever les autres protéines 2ème lavage pour éluer la protéine fixée

26 Comparaison des trois types de chromatographie:

27 3.3-Électrophorèse 3.3.1-Électrophorèse sur papier
3.3.2-Electrophorèse non dénaturante sur gel de porosité  ou  3.3.3-Électrophorèse en SDS-page 3.3.4-Électrophorèse sur gradient de pH (focalisation isoélectrique ou électrophocalisation)

28 3.3-L'électrophorèse: Déplacement d'ions dans un champ électrique.
La force électrique, Félectrique, qui s'exerce sur un ion porteur d'une charge q dans un champ électrique de potentiel E est : Félectrique = qE La force de friction s'oppose au déplacement électrophorétique: Ffriction = vf v est la vitesse de déplacement de l'ion et f est son coefficient de friction. f: dépend de la taille, de la forme et de l'état de solvatation de l'ion ainsi que de la viscosité de la solution.

29 3.3-L'électrophorèse: Mr = pHe – pHi / MM
Dans un champ électrique constant, les forces qui s'exercent sur l'ion s'équilibrent : qE = vf Ainsi la vitesse de l'ion est équivalente à : La mobilité Mr d'un ion se définit par: Mr = pHe – pHi / MM Des protéines différentes se déplacent à des vitesses différentes en raison de de leurs charges (proportionnelle à pHe – pHi) et de leurs coefficients de friction (inversement proportionnelle à MM).

30 3.3-L'électrophorèse:

31 3.3.1-Électrophorèse sur papier
Papier filtre ou acétate de cellulose Champ électrique: env. 20 V/cm cathode (-): attire les cations (+) anode (+): attire les anions (-)

32 3.3.1-Électrophorèse sur papier
Important: Dans l'électrophorèse sur papier: Les molécules sont séparés en fonction de leurs masses molaires et leurs charges Dans la chromatographie sur papier: Les molécules se séparent en fonction de leur caractère polaire

33 3.3.2-Électrophorèse en gel:
Gels avec pores de dimensions moléculaires de taille variable Polyacrylamide: petite taille des pores Agarose: grande taille des pores La taille des pores varie aussi avec la concentration des gels Plus la concentration , plus la taille  La séparation des molécules repose sur: Gel-filtration (grosses molécules ralenties par rapport aux petites)

34 3.3.2-.Électrophorèse en gel:
Migration des molécules dans un champ électrique Les grosses molécules sont ralenties par rapport aux petites Chromatographie en gel-filtration: Migration des molécules par gravité Les petites molécules sont ralenties par rapport aux grosses

35 3.3.2-.Électrophorèse en gel:
Migration selon la taille et la charge des molécules Les plus chargées (-) migrent plus loin vers l'anode Pour deux molécules de même charge: Les plus petites migrent plus loin que les plus grosses La charge des molécules dépend du pH du tampon

36 3.3.3-Electrophorèse à pH fixe sur gel de porosité  ou 
Dans ce type d’électrophorèse on annule l’effet du pHi Les molécules protéiques non dénaturées arrêtent leurs migration dès que le gel devient impénétrable Méthode utilisée également pour la détermination de la MM des protéines: me = -a log MM + b

37 Détection des protéines en électrophorèse:
Les bandes du gel peuvent être détectées par: Coloration des protéines par complexation avec un colorant (bleu de Coomassie) Précipitation Ag/Ac (immunoblotting) Comptage radioactif

38 3.3.3-Électrophorèse en SDS-page :
Le SDS est un détergent anionique qui couvrent la totalité de la protéine ce qui brise les interactions et détruit les structures tertiaires et quaternaires La mobilité électrophorétique (me) des protéines en SDS-PAGE est inversement proportionnelle au logarithme de sa masse moléculaire. SDS-PAGE utilisé pour déterminer la masse moléculaire d'une protéine ou de ses sous-unités, en utilisant des protéines « marqueurs » de masses moléculaires connues. Méthode utilisée pour la détermination de la MM des sous unités protéiques: me = -a log MM + b On peux explorer la structure quaternaire d’une protéine en comparant les différentes MM des sous unité obtenues dans les conditions ND, DNR et DR.

39 Principe de la formation SDS-Protéine

40 3.3.3-Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM
+ KD 97 45 31 21 14 -

41 3.3.3-Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM de la protéine
KD 97 45 31 21 14

42 PM de P non dénaturée/ PM de P dénaturée = nombre de sous unité
3.3.3-Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM de sous unité de la protéine électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions non dénaturante: séparation des molécules protéiques natives (non dénaturées) en fonction de leur charge nette et de leur PM électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturante réductrice (SDS et b mercaptoéthanol qui entraîne une réduction de pont disulfure): séparation des sous unités des molécules protéiques dénaturées en fonction de leur PM PM de P non dénaturée/ PM de P dénaturée = nombre de sous unité

43 3.3.4-Focalisation isoélectrique
Repose sur les différences de pI entre protéines. Une première électrophorèse est effectuée avec une solution de molécules amphotères à travers un gel. La migration de ces molécules dans un champ électrique crée un gradient de pH au niveau du gel. Les molécules amphotères vont se répartir en fonction de leurs pI: les plus acides se rassemblent vers l'anode les plus basiques se positionnent vers la cathode Ainsi, le pH  de l'anode vers la cathode.

44 3.3.4- Focalisation isoélectrique
La solution de protéines est ensuite déposée sur le gel pour effectuer une seconde électrophorèse. Les protéines se déplacent dans le gradient de pH du gel, jusqu'à ce qu'elles arrivent à une zone correspondant à leur pI respectif. À ce pI, les protéines n'auront plus de charge nette, elles vont donc arrêter de migrer. Chaque protéine se trouve donc concentrée sous forme d'une bande étroite autour de son point isoélectrique à ± 0.01 unités de pH.

45 3.3.4- Focalisation isoélectrique
Ampholytes basiques Ampholytes acides

46 3.3.5- Electrophorèse bidimensionnelle

47 3.4-Electrochromatographie (carte peptidique, empreinte digital ou finger print)

48 Protéines et maladies héréditaires
Ex. anémie falciforme Globules rouges normaux Globules rouges anormaux (anémie falciforme)

49 L'hémoglobine est formée de quatre chaînes d'acides aminés: 2 chaînes dites  et 2 chaînes dites .

50 Mutation a touché la polarité et la charge de la protéine
Hémoglobine normale (chaîne ) Mutation a touché la polarité et la charge de la protéine Hémoglobine anormale (anémie falciforme)

51 Contrôle de la purification des protéines
Trois paramètres permettent de suivre let d’évaluer l’efficacité d’une purification R%= Qté de P à chaque étape/ Qté de P de départ R% = Activité enzymatique à chaque étape/ Activité enzymatique de départ AS = Activité enzymatique à chaque étape/ Qté de P à chaque étape IP = AS à chaque étape /AS de départ

52 Évolution des paramètres de la purification

53 Méthodes de détermination de la masse moléculaire des protéines
1- méthode chimique: Elle repose sur le dosage d’un constituant de très faible proportion dans la molécule protéine. Le PM min est établi en postulant qu’il n’existe qu’une seul molécule du constituant par molécule protéique PMmin de P / PM du C = % de P / % du C = 100% de P / % du C PMmin = PM du C X 100 / % du C Le PM réel= n x PM de P; n étant le nombre de répétition du C dans la molécule de P.

54 Méthodes de détermination de la masse moléculaire des protéines
2- par chromatographie d’exclusion diffusion KD= (Ve - V0 ) / (Vt – V0 ) = -a log MM + b Détermination de la MM de la protéine native 3- par électrophorèse non dénaturante me = -a log MM + b ou mr = ma–ml/mr-ml= -alogMM+b 4- par électrophorèse SDS-age me = -a log MM + b Détermination des MM des sous unités (CDNR) 5- par électrophorèse SDS-age + b mercaptoéthanol: Détermination des MM des sous unités (CDR)

55 Détermination des MM des protéines dans les conditions ND (1), DNR (2) et DR (3): Application à la détermination de la structure IVaire du Glutathion