I. Recherche du gène correspondant aux séquences initiales.

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1 I. Recherche du gène correspondant aux séquences initiales

2 Recherche du gène correspondant aux séquences Recherche effectuée dans la banque ncbi grâce au logiciel blastn Paramètres: - word size = 11 -> bonne sélectivité même si on a une perte de sensibilité - affichage des résultats ayant une e-value inférieure à 10 Résultats: - blast avec oli1: 2 hits trouvés, dont le meilleur hit (20/20) correspondant à la séquence du plasmide pWWO de la bactérie Pseudomonas putita - blast avec oli2: 28 hits, on retrouve le plasmide pWWO comme 2ème meilleur hit, les autres séquences étant issues de vecteurs d'expression construits à partir de pWWO - blast avec oli3: 2 hits trouvés, dont le meilleur hit (20/20) correspondant à la séquence du plasmide pWWO de la bactérie Pseudomonas putita On déduit de ces résultats que ces séquences proviennent d'un gène situé sur le plasmide pWWO de la bactérie Pseudomonas putita.

3 Obtention de la séquence protéique du gène correspondant D'après les résultats du blast, oli1 matche avec le plasmide pWWO entre les nucléotides 42849 et 42830. On retrouve ainsi la séquence nucléotidique du gène: il s'agit de XylR, protéine régulatrice de l'opéron Xylose Grâce au fichier Genbank, nous avons accès directement à la séquence protéique: >XylR MSLTYKPKMQHEDMQDLSSQIRFVAAEGKIWLGEQRMLVMQLST LASFRREIISLIGVERAKGFFLRLGYQSGLMDAELARKLRPAMREEEVFLAGPQLYAL KGMVKVRLLTMDIAIRDGRFNVEAEWIDSFEVDICRTELGLMNEPVCWTVLGYASGYG SAFMGRRIIFQETSCRGCGDDKCLIVGKTAEEWGDVSSFEAYFKSDPIVDERYELQTQ VANLRNRLKQYDGQYYGIGHSPAYKRICETIDKAARGRVSVLLLGETGVGKEVIARSV HLRSERAEQPFVAVNCAAIPPDLIESELFGVDKGAYTGAVNARAGRFERANGGTIFLD EVIELTPRAQATLLRVLQEGELERVGGDRTRKVDVRLITATNENLEEAVKMGRFRADL FFRLNVFPVHIPPLRERVEDIPLLVEHFLRRHHKEYGKKTLGLSDRAMEACLHYQWPG NIRELENALERGVILTESNESINVESLFPGLATATEGDRLSSEGRLEEESGDSWFRQI IDQGVSLEDLEAGLMRTAMDRCGQNISQAARLLGLTRPAMAYRLKKLDPSLSVKAMGR

4 Alignements de oli1 et oli2 avec XylR (Bien que le blast avec oli3 donne un match de 20/20 avec XylR, il ne s'aligne pas bien en réalisant un alignement avec Clustal)

5 II. Recherche des gènes proches de XylR chez Pseudomonas putita

6 On cherche à faire une recherche exhaustive des gènes de la même famille que XylR chez Pseudomonas putita -> Utilisation du logiciel BlastP Problème: On ne peut pas effectuer le blast chez cet organisme exclusivement, on effectue donc la recherche chez toutes les bactéries. Les paramètres utilisés sont les suivants: - taille du mot = 3 - matrice de substitution: BLOSUM62 - gap existence penalty = 11 - gap extension penalty = 1 On choisit d'afficher les résultats ayant une e-value inférieure à 10. Résultats: On obtient 1003 séquences dans un grand nombre de bactéries. On considère que la recherche a été exhaustive, et il faut maintenant sélectionner parmi ces séquences les gènes issus de Pseudomonas putita.

7 Les gènes proches de XylR chez Pseudomonas putita Grâce à l'utilisation d'un moteur de recherche d'un éditeur de texte, on retrouve les séquences de Pseudomonas putita parmi les 1003 séquences bactériennes. On obtient 20 séquences correspondant à des facteurs de transcription impliqués dans la régulation de voies métaboliques diverses:

8 III. Alignement de XylR avec les gènes de Pseudomonas putita

9 L'alignement est réalisé à l'aide du logiciel clustal. On insère aussi une séquence d'Arabidopsis thaliana trouvée par BlastP afin de constituer un groupe externe pour la suite.

10 IV. Réalisation d'un arbre phylogénétique des gènes proches de XylR chez Pseudomonas putita Peut-on reconstituer des familles et des sous-familles parmi ces gènes chez cet organisme?

11 L'arbre est construit par la méthode de Neighbor Joining à l'aide du logiciel NJplot (groupe externe)

12 V. Recherche de domaines structuraux

13 On cherche à savoir si les domaines structuraux trouvés avec blastp sur XylR sont conservés dans les protéines de la famille XylR_N: domaine de fixation au xylose V4R: Vinyl 4-reductase AAA: ATPase Activator HTH_8: domaine hélice-boucle-hélice

14 XylR_N V4R AAA