Réunion BoB du 19 mai 2010 Présentation par Arthur de Fouchier

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1 Réunion BoB du 19 mai 2010 Présentation par Arthur de Fouchier
Expression du système endothéline et effet sur la prolifération dans la muqueuse et le bulbe olfactif de rat Réunion BoB du 19 mai 2010 Présentation par Arthur de Fouchier

2 Rappel des données : Système endothéline : 3 peptides connus : Et-1, Et-2, Et-3 2 RCPG : EtA et EtB Antagonistes : Bq788 et Bq123 (respectivement) Synthèse sous forme de prépro-Et, clivés par furine pour donner Big-Et puis clivés par Ece-1 pour donner les Et actives. Effet Vasoconstricteur dans un nombre important de tissus Notamment système nerveux Maria Vidovic et al (2008) et Wei-Min Zhang et al (2008) :  Preuves d’effets prolifératifs et anti-apoptotique de l’endothéline sur différent tissus et cellules

3 Rappel des données : Mac Cumber et al (1989) : Expression de recepteurs à l’endothéline dans la muqueuse olfactive d’embryons de rats ET binding sites in the 19-day rat fetus. (B) ET binding Sites. Cb, cerebellum; H, heart; I, intestine; Li, liver; Lu, lung; M, meninges; NM, nasal mucosa; P, penis.

4 Rappel des données : Système endothéline est exprimé dans les cellules de la muqueuse olfactive Résultats Immunohistochimie : Cellules non-neuronales Neurones Endothelin-related mRNAs from adult rats OM (OM adult), and newborn rats (P0–P7) OM cells prepared at the time of culture (0 DIV), or after 7 and 17 days in vitro (7 and 17 DIV) (n3 independent cultures for each). PCR products for ETA, ETB, ECE-1, ET-1 and ET-3 mRNAs were detected on 1.5% agarose gels stained with Ethidium Bromide. Negative controls consisting of PCR without DNA matrix were systematically performed (C lane). Elodie Gouadon et al. (2010)

5 Rappel des données : Elodie Gouadon et al. (2010) : Preuves d’effets de l’endothéline sur des cultures primaires de muqueuse olfactive. (Graph?/ Schéma) Iman Laziz (Publication en cours) : Preuves d’effets anti-apoptotique de l’endothéline. Et-A Et1 Et-B

6 Questions posées par ces données
Sites de synthèse de l’endothéline et de l’enzyme de conversion dans la MO? Types cellulaires? Effets de l’endothéline sur la prolifération des cellules de la MO?

7 Matériels et méthodes Hybridations In Situ pour Et-1, Et-3 et Ece-1 sur des coupes de muqueuses olfactives, et de bulbe olfactif. Contrôle par OMP. Préparation des sondes : PCR à partir d’ADN génomique de rat et d’amorces spécifiques Ligation avec plasmides pGEMt Transfection dans bactérie Xl2-blue Extraction plasmides Synthèse sondes par transcription in vitro Dig-dUTP (Sp6, T7) Contrôle marquages des sondes :

8 Matériels et méthodes Test protocole d’HIS :
CN EO SM Mi EPL Gl BO MO Le transcrit OMP est bien détecté dans la MO par le protocole d’HIS utilisé. Hybridation in situ de sondes OMP7 sur des coupes de muqueuse olfactive et de bulbe olfactif de rat Ctrl : sans sonde S : Hybridation avec sondes sens. A-S : Hybridation avec sondes anti-sens. BO : Bulbe Olfactif Mi : Cellules Mitrales EPL : Zone Plexiforme Externe Gl : Glomerules MO : Muqueuse olfactive SM : Sous-muqueuse CN : Cavité Nasale EO : Epithélium Olfactif

9 Résultats – HIS ET-1 Le transcrit Et-1 est présent au niveau apical et médian de l’EO. Dans le BO, l’expression du transcrit Et-1 est détectée au niveau des cellules periglomérulaires. Le marquages des cellules mitrales semble peu spécifique. MO BO Hybridation in situ de sondes Et-1 sur des coupes de muqueuse olfactive et de bulbe olfactif de rat. Ctrl : sans sonde, S : Hybridation avec sondes sens, A-S : Hybridation avec sondes anti-sens.

10 Résultats – HIS Et-3 On observe surtout un marquage non-spécifique.
Hybridation in situ de sondes Et-3 sur des coupes de muqueuse olfactive et de bulbe olfactif de rat. Ctrl : sans sonde, S : Hybridation avec sondes sens, A-S : Hybridation avec sondes anti-sens. BO On observe surtout un marquage non-spécifique. Mélange sonde suspecté ou expression d’Et-3 dans les deux sens? MO

11 Résultats – HIS Ece-1 Dans l’EO, le transcrit Ece-1 est exprimé dans une majorité des cellules medianes. Dans le BO, le marquage avec Ece-1 semble spécifique seulement au niveau des cellules periglomérulaires MO BO BO Hybridation in situ de sondes Ece-1 sur des coupes de muqueuse olfactive et de bulbe olfactif de rat. Ctrl : sans sonde, S : Hybridation avec sondes sens, A-S : Hybridation avec sondes anti-sens.

12 Résultats – Cultures Cellulaires
Cultures cellulaires  Cultures type « Denise » Etude prolifération : 3H-T Mesure chiffrée de la prolifération. BrdU Quantification du pourcentage de cellules en phase S. Ki67 Antigène marqueur de prolifération.

13 Résultats Quantification prolifération par 3H-T:

14 Résultats Cultures en boites B12 :
 Aucun effet prolifératif de l’endothéline dans les conditions expérimentales. Effet prolifératif des Bq? Soit, l’endothéline a des effets anti-prolifératifs et il y a une production locale d’endothéline saturante. Soit l’endothéline a des effets différentiateur. Soit Bq a un effet sur une autre voie. Cultures en boites P96 : Cultures se développent bien En sérum 10% : Et-1 et Bq ont un effet prolifératif. En sérum 2%, Et-1 semble avoir un effet négatif sur la prolifération  Théorie différentiation

15 Résultats Marquage Ki67 sur culture de 7J
Marquage BrdU sur culture de 7J Aucune analyse pour le moment

16 Perspectives Expression du système endothéline : HIS avec co-marquage
FISH + Immunohistochimie par fluorescence co-marquage avec réactions colorimétriques Marquage de coupes successives Une coupe HIS Une coupe immunofluorescence avec marqueurs de types cellulaires Effets sur la prolifération : Besoin de confirmer les résultats par d’autres cultures Test théorie différentiation par marquages en immunofluorescence de cultures