Méthodes Analytiques pour études toxicologiques

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1 Méthodes Analytiques pour études toxicologiques
Marlène Lacroix 26/01/2012

2 Analytique dans les Etudes toxicologiques
Evaluation de la contamination : Matrices environnementales (sols, air, eaux, aliments…) Source d’exposition Absorption Distribution Métabolisme Elimination Etude du contaminant et des ses métabolites dans l’organisme : Matrices biologiques (sang, tissus, urines, fèces…) Etude de biomarqueurs : Endogènes (Hormones, Acides aminés, Lipides…) ou exogènes dans matrices biologiques Effets biologiques

3 (Elisa, RIA, Chemiluminescence)
Les techniques analytiques principales Chromatographique (HPLC, GC, CE) Immunochimique (Elisa, RIA, Chemiluminescence)

4 Dosage avec compétition Dosage sans compétition
Dosage immunochimique : Principe Principe basé sur la reconnaissance spécifique antigène – anticorps 2 méthodes de dosage : Réactifs en excès (dosage sans compétition) Réactifs limitant (dosage avec compétition) Classification des méthodes de dosage : Traceur Dosage avec compétition Dosage sans compétition Radiomarqué Radioimmunoassay (RIA) Immunoradiometric assay (IRMA) Enzyme Enzymoimmunoassay (EIA) Enzyme-labeled immunosorbent assay (ELISA) Fluorescent Fluoroimmunoassay (FIA) Immunofluorometric assay (IFMA) Luminescent Luminoimmunoassay (LIA) Immunoluminometric assay (ILMA)

5 Dosage immunochimique sans compétition
Reconnaissance spécifique antigène – anticorps Plaque 96 Puits Introduction des anticorps Introduction de l’échantillon Liaison de la molécule d’intérêt avec l’anticorps Anticorps Molécules à doser Autres Molécules

6 Dosage immunochimique sans compétition
Reconnaissance spécifique antigène – anticorps Plaque 96 Puits Introduction des anticorps Introduction de l’échantillon Liaison de la molécule d’intérêt avec l’anticorps Lavage, retrait des molécules non liées Anticorps Molécules à doser Autres Molécules

7 Dosage immunochimique sans compétition
Plaque 96 Puits Introduction des anticorps Introduction de l’échantillon Liaison de la molécule d’intérêt avec l’anticorps Lavage, retrait des molécules non liées Anticorps Molécules à doser Anticorps de détection Ajout d’un 2ème anticorps

8 Dosage immunochimique sans compétition
Plaque 96 Puits Introduction des anticorps Introduction de l’échantillon Liaison de la molécule d’intérêt avec l’anticorps Lavage, retrait des molécules non liées Anticorps Molécules à doser Anticorps de détection Ajout d’un 2ème anticorps Lavage et retrait des anticorps en excès L’anticorps de détection peut être radiomarqué ou fluorescent

9 Dosage immunochimique sans compétition
Cas des dosages ELISA : Enzyme-Labeled ImmunoSorbent Assay Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à l’anticorps de détection Anticorps Molécules à doser Anticorps de détection Anticorps secondaire lié à une enzyme

10 Principe ELISA Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à l’anticorps de détection Un substrat de l’enzyme est ajouté et l’enzyme le converti en une forme détectable (colorée ou fluorescente) Anticorps Molécules à doser Anticorps de détection Anticorps secondaire lié à une enzyme Substrat

11 Principe ELISA Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à l’anticorps de détection Un substrat de l’enzyme est ajouté et l’enzyme le converti en une forme détectable (colorée ou fluorescente) Anticorps Molécules à doser Anticorps de détection Anticorps secondaire lié à une enzyme Substrat Substrat converti

12 Dosage immunochimique sans compétition
Interprétation des résultats : Réponse du signal quantifiée par spectrométrie (UV, Fluorescence…) ou par compteur de radioactivité : compteur β (H3…) , compteur γ ( I125…) Dosage sans compétition : Intensité du signal proportionnelle à la concentration de la substance à doser Réponse du signal Concentration Domaine quantifiable

13 Dosage immunochimique avec compétition
Anticorps (limitant) Antigènes à doser Antigènes marqués (en excès)

14 Dosage immunochimique avec compétition
Réponse du signal quantifiée par spectrométrie (UV, Fluorescence…) ou par compteur de radioactivité : compteur β (H3…) , compteur γ ( I125…) Dosage avec compétition : Intensité du signal inversement proportionnelle à la concentration de la substance à doser Anticorps (limitant) Antigènes à doser Antigènes marqués (en excès) Réponse du signal Domaine quantifiable 14 Concentration

15 Méthodes chromatographiques :Principe
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Pompes A B Colonne Détecteur Injecteur Bille de silice greffée

16 Une histoire d’affinité …
Phase stationnaire Analytes Phase mobile Polaires Apolaire Phase directe Polaire Détecteur Chromatogramme Intensité temps

17 Une histoire d’affinité …
Phase stationnaire Analytes Phase mobile Polaires Apolaire Phase directe Polaire Détecteur Chromatogramme Intensité temps

18 Une histoire d’affinité …
Phase stationnaire Analytes Phase mobile Apolaires Polaire Phase inverse Apolaire Détecteur Chromatogramme Intensité temps

19 Détecteurs Caractérisés selon leur sélectivité et leur sensibilité
Les plus répandus pour analyse de biomolécules: UV et Fluo Faisceau lumineux à λ dans ultraviolets Excitation de la molécule Détection UV Limite de quantification de l’ordre µg/mL Émission de la lumière Détection Fluorescence Limite de quantification de l’ordre ng/mL Sensibilité x1000

20 Spectromètre de masse Source Analyseur Détecteur
Séparation des ions m/z produits Comptage des ions Amplification du signal Formation des charges Ionisation des molécules Ex: Trappe d’ion Traitement informatique Ex: Electrospray Ex : Quadripôle

21 Source electrospray (ESI)
Ionisation des molécules en sortie de colonne Cône Sortie de colonne Sonde electrospray

22 Vers l’analyseur… Mesure le rapport m/z d’une molécule Exemple 1 :
m = masse monoisotopique z = charge Exemple 1 : Aspirine (acide acétylsalicylique) Milieu basique + H+ chargée <0 z = 1 9 atomes de Carbone (mC = 12) 8 atomes d’Hydrogène (mH = 1) 4 atomes d’Oxygène (mO = 16) maspirine = 9 x12 +8 x1 + 4x16 = 180 Abondance relative % 179 Rapport m/z = 179/1 = 179 m/z massif isotopique

23 Mesure le rapport m/z d’une molécule
Exemple 2 : Mesure le rapport m/z d’une molécule Dérivé de vancomycine R H+ H+ Formule : C80H87Cl3F3N11O24 Masse monoisotopique = 1750 Plusieurs sites basiques Spectre de masse : Chargé 2x m/z = (1750+2)/2 = 876 Chargé 3x m/z = (1750+3)/3 = 584 Chargé 1x m/z = =1751

24 Exemple : Analyseur quadripolaire
quadripôle

25 Avec un triple quadripôle
Appareil de référence pour études quantitatives Q1 Q2 Q3 Source Détecteur Cellule de collision Mode d’analyse « MS » simple « SIM »  sélection d’ion « MS/MS » fragmentation « MRM » mode pour la quantification

26 Mode d’analyse Q1 Q2 Q3 « MS » simple « SIM » sélection d’ion
ions Les quadripôles laissent passer tous les ions + Spécifique - Spécifique « MS » simple « SIM »  sélection d’ion « MS/MS » fragmentation « MRM » mode pour la quantification Applications en bioanalyse : Études de pureté Quantification (concentration de l’ordre du µg/mL)

27 Mode d’analyse Q1 Q2 Q3 « MS » simple « SIM » sélection d’ion
ions Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini + Spécifique - Spécifique « MS » simple « SIM »  sélection d’ion « MS/MS » fragmentation « MRM » mode pour la quantification Applications en bioanalyse : Quantification Screening de molécules Concentrations µg/mL

28 Mode d’analyse Q1 Q2 Q3 « MS » simple « SIM » sélection d’ion
Énergie de collision : gaz inerte (argon) Ions « fils » Ions Ion « père » Q1 Q2 Q3 Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini Fragmentation dans le deuxième quadripôle + Spécifique - Spécifique Passage des ions fils dans le troisième quadripôle « MS » simple « SIM »  sélection d’ion « MS/MS » fragmentation « MRM » mode pour la quantification Applications en bioanalyse : Études structurales(métabolomique, protéomique…) Quantification (+ sensible que MS ou SIM) « MS/MS » fragmentation

29 Mode d’analyse Q1 Q2 Q3 « MS » simple « SIM » sélection d’ion
Énergie de collision : gaz inerte (argon) Ions Ion « père » Ions « fils » Q1 Q2 Q3 Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini Fragmentation dans le deuxième quadripôle + Spécifique - Spécifique Sélection d’un ion fils dans le troisième quadripôle « MS » simple « SIM »  sélection d’ion « MS/MS » fragmentation « MRM » mode pour la quantification Applications en bioanalyse : Quantification Screening de molécules Concentrations ng/mL

30 Σ Couplage LC/MS Spectromètre de masse utilisé comme détecteur
Chromatogramme Intensité Temps Σ Spectres de masse Abondance relative % Rapport m/z

31 Avantages – Inconvénients
Immunochimie Chromatographie Méthodes rapides Méthodes sensibles Forte capacité d’échantillon Utilisation facile LC/MS spécifique Dosages de plusieurs molécules en une analyse Pas toujours sélectives Dosage 1 molécule à la fois Elaboration difficile Purification échantillon nécessaire Durée analyse Coût appareillage élevé

32 Application : études toxicocinétique/Toxicodynamie
Réponse biologique Profils de concentration Toxicodynamie Dose Toxicocinétique Quantification du contaminant (et métabolites) Etudes de biomarqueur Collecte Analyse Toxicocinétique Administration

33 Administration Produit chimique, produit naturel isolé, etc.
Choix d’un solvant d’aministration Documenter la stabilité du produit Attention aux substances peu solubles Verifier les doses administrées (analytique) Produit de formulation Essai pilote Doses commerciales (produits pharmaceutiques) Peu être inexacte Impuretés (± 5%) Se référer à la directive pour les produits pharmaceutiques Good Manufacturing Practice (GMP) Vérifier les doses administrées (analytique) Mode d’administration Perfusion, Bolus…. Doses simples, multiples Voie d’administion (IV reference, orale….) A définir dans le protocole expérimental

34 Stratégie de prélèvement
Pour chaque spécimen collecté il faut garantir : Un bon prélèvement Ponction ou cathéter (prélèvement sanguin) Site de prélèvement (veine, artère…) Temps de prélèvement (durée, cycle circadien, …) Un bon traitement ou préparation des spécimens Sang total, plasma, serum… Tubes de collecte (anticoagulant, type de tube…) Conditions de centrifugation Filtration (urines) Une bonne conservation pour s’assurer de la stabilité des substances et de leurs métabolites Température de conservation (-20°C, -80°C…) Durée de conservation avant analyse A définir dans le protocole expérimental

35 Analyse et validation de méthodes
Valeurs des concentrations les plus fiables possibles paramètres fondamentaux Sélectivité/spécificité Linéarité Exactitude Précision (répétabilité/reproductibilité) Sensibilité Stabilité Certifie que la méthode est appropriée pour une utilisation routinière Texte de Référence : Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM), May 2001

36 Sélectivité/Spécificité
Définitions : Sélectivité : Capacité à différencier et quantifier un analyte en présence d’autres substances dans la matrice Spécificité : Propriété de la méthode analytique de convenir exclusivement à l’analyte avec la garantie que le résultat ne provient que de l’analyte. (absence interférence) Exemple : T (min) Réponse Aire interférence < 5% LOQ Aire à LOQ

37 Linéarité : courbe de calibration
Définition : Rapport entre les concentrations connues et les réponses analytiques expérimentales (observées). Objectif : Déterminer les concentrations des échantillons Chromatogramme : SI Analyte Utiliser un standard interne et utiliser le ratio :

38 Origine de l’erreur : Précision et exactitude
Erreur systématique (non aléatoire) Biais Impossible de le corriger C’est l’exactitude (accuracy) Erreur aléatoire On peut l’évaluer avec des statistiques C’est la précision Illustration avec des cibles Méthode précise et exacte Méthode peu précise et exacte Méthode précise et biaisée Méthode peu précise et biaisée

39 Mesure de l’exactitude
L’exactitude d’une méthode analytique est l’étroitesse de l’accord entre la moyenne d’une série de concentration obtenue par le modèle et la concentration réelle de l’analyte. X Points QC « Quality Controle » 5 QC à 3 niveaux de concentrations: (Bas (3*LOQ), Milieux, Haut) Comparaison entre moyenne des concentrations calculées et valeur théorique Exactitude (%) = 100 x Moy Cpréd - Cnom Cnom +100 Critères d’acceptabilité : 85 % < Exactitude <115 %

40 Mesure de la précision La précision d’une méthode analytique mesure l’écart de chaque mesure individuelle par rapport à la moyenne des mesures d’un volume d’échantillon unique et homogène X1 X2 Points QC « Quality Controle » 5 QC à 3 niveaux de concentrations Précision intra-jour (répétabilité) Précision inter-jour (reproductibilité) Evaluation sur 3 jours Calculée avec le coefficient de variation (CV%) CV % = Écart type Moyenne X 100 Pour une précision intra-jour et/ou inter-jour sur plusieurs concentrations : Analyse de variance (ANOVA) Critères d’acceptabilité : CV < 15 %

41 Sensibilité : LOD et LOQ
Définition : la limite de détection (LOD) est la plus petite concentration de l’analyte pouvant être détectée et différencier du bruit de fond. En général, elle est évaluée à 3 x le bruit de fond du signal. la limite de quantification (LOQ) est la plus petite concentration de l’analyte pouvant être quantifiée avec une exactitude et une précision appropriée. Domaine d’analyse : LOD LOQ LOD Non détectable Domaine détectable Domaine quantifiable Mesure de la LOD : Injection de six blancs matrices et mesure de la réponse Calcul de la concentration en retour moyenne x 3 = LOD Mesure de la LOQ : Injection de 5 points de LOQ et calcul des concentrations Critère d’acceptabilité : CV < 20 % et exactitude entre 80 et 120 %

42 Stabilité La stabilité de l’échantillon doit être évaluée à toutes les étapes précédent l’analyse. Critère d’acceptabilité : Il n’y a pas de valeurs réglementaires Stabilité des solutions mères et filles Stabilité à cours terme Stabilité à long terme Cycle de congélation-décongélation Stabilité post – extraction On s’autorise une variation de 5% On s’autorise une variation de 15%

43 Dosage en routine Chaque jour de dosage : Critère d’acceptation :
1 gamme + 2 séries de QC à trois niveaux de concentrations par jour. 1 série valide la gamme du jour et une série en fin de dosage valide les échantillons Critère d’acceptation : 75% des points de la gamme doivent avoir une variation ± 15% par rapport à leur valeur nominale (sauf à la LOQ ± 20%) 2 QC sur 6 QC peuvent être au-delà de ±15% de variation (mais pas au même niveau de concentration)

44 Exemple : Etude Toxicologique du fipronil
Fipronil : Insecticide à usage phytosanitaire ou vétérinaire Interdit en France en 2004 Substance vétérinaire la plus commercialisés au monde Métabolite principal : Fipronil sulfone (-SO2CF3) Potentiel perturbateur endocrinien : Effet sur hormones thyroïdiennes Risque pour la santé humaine lié à l’exposition au fipronil?

45 Exemple : Etude Toxicologique du fipronil
Objectif : Evaluer les effets du fipronil et de son métabolite sur les hormones thyroïdiennes Réponse biologique Profils de concentration Toxicodynamie Dose Toxicocinétique Protocole : Gavage 14 jours Fipronil Fipronil sulfone Solvant Administration IV ou VO Fipronil Fipronil sulfone Solvant Dosage Fipronil et métabolite par LC/MS Administration IP Thyroxine (T4) à chaque groupe Dosage T4 par RIA Plasma 6 jours (IV) 9 jours (VO) 10 pts/cinétique Plasma 24H 8 pts/cinétique Réponse biologique : Clairance et métabolisme T4 IV : Paramètres TK (t1/2, CL…) VO : Biodisponibilité Rats THX + T3 (SC) Cathétérisés Dosage T4 et métabolites par LC/MS

46 Exemple : Etude Toxicologique du fipronil
Résultats TK : A: voie intraveineuse B: voie orale Fipronil sulfone Fipronil Fabs ≈ 1 quelque soit la molécule

47 Exemple : Etude Toxicologique du fipronil
Résultats TD (dosage RIA) : A: T4 totale B: T4 libre * ** * P < 0.05 ** P < 0.01 * P < 0.05 ** P < 0.01

48 Exemple : Etude Toxicologique du fipronil
Résultats TD (dosage LC/MS) : Permet de doser la T4 et ses métabolites T4 T3 Dernière SC T3 Concentrations plasmatiques (ng/mL) Concentrations plasmatiques (ng/mL) Temps (Hr) Temps (Hr) T2 Modification du profil de la T4 et de ses métabolites en présence de Fipronil ou de Fipronil Sulfone Concentrations plasmatiques (ng/mL) Importance d’évaluer les molécules mères mais aussi les métabolites formés Temps (Hr)