Diagnostic bactériologique de la tuberculose Nouvelles techniques

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1 Diagnostic bactériologique de la tuberculose Nouvelles techniques
V. Lalande Service de Bactériologie-Virologie Hôpital Saint-Antoine

2 Mycobacterium tuberculosis
Bacille de Koch 1882 Bacille acido-alcoolo-résistant Croissance lente Diagnostic bactériologique: 70% des tuberculoses

3 Bacilloscopie Ziehl-Neelsen X 1000 Auramine O Sensibilité
 Temps de lecture (2 min)  artefact X400 Microscope Fluorescence ou LED

4 PERFORMANCES de la MICROSCOPIE
Non spécifique: BAAR Peu sensible : à 104 BAAR/ml Tuberculoses pulmonaires (M+) Adulte % Enfant < 20% HIV % Tuberculoses extra-pulmonaires M %

5 Diagnostic de la tuberculose fin XXème siècle
Prélèvement Fluidification - Décontamination Culot de centrifugation M+ Antibiogramme direct 4 sem. Milieu solide  3 à 6 sem. Identification biochimique 3 sem. Antibiogramme 3 à 4 sem. Délai de 4 à 12 semaines

6 Evolution des techniques diagnostiques de la tuberculose
Prélèvement Fluidification - Décontamination Culot de centrifugation Amplification génique Milieu solide  3 à 6 sem. Identification biochimique 3 sem. Antibiogramme 3 à 4 sem.

7 Place de l’amplification génique
Réponse rapide (24h) Bonne spécificité (95 – 100%) Manque de sensibilité (M-) Faux négatif (inhibiteur, faible volume d’échantillon) Faux positif Contamination croisée

8 Méta analyses sur les tests d’amplification génique
Nbre d’études incluses Type de tuberculose Sensibilité (%) Spécificité Sarmiento et al 2003 50 Pulmonaires (M-) 9 -100 Piersimoni and Scarparo, 2003 >50 et extraPulm 27-100 91-100 Pai, 2003 49 Méningite 0-100 Pai, 2004 40 Pleurésie 20-100 53-60 Amplicor™ Cobas Roche (PCR) AMTDT ™ Gen-Probe Amplification-transcript° (TMA) LCx -MTB™ Abbott Amplification-ligation (LCR)

9 Place de l’amplification génique
Recommandations actuelles Ne remplace pas le diagnostic traditionnel Toujours associée à la culture Analyse critique Un résultat négatif n’exclut pas le diagnostic de tuberculose Un résultat positif doit être confronté à la clinique Utilisation préférentielle sur les prélèvements M+ traitement orienté et levée d’isolement Ne pas utiliser pour le suivi du traitement ATS, recommandations 1997

10 En développement PCR temps réel
Quantitative nested RT, Applied Biosytems Takahashi et al JCM, 2008 Xpert™ MTB , Cepheid PCR Multiplex (MTB et rpoB S et mutants) M+ (Se : 100%) M-C+ (Se :70%) Spe 96% Inactivation /cartouche unitaire (90 min) ECCMID 2008, Jones et al

11 Diagnostic de la tuberculose évolution de la culture
Prélèvement Fluidification - Décontamination Culot de centrifugation Milieux liquides Respirométrie Milieu solide  3 à 6 sem.  1 à 4 sem. Identification biochimique 3 sem. Antibiogramme 3 à 4 sem.

12 Respirométrie non radiométrique Visualisation des colonies
Milieux liquides Visualisation des colonies Bact/Alert™  pH MGIT™960  O2  fluo Lecture hebdomadaire Lecture index de croissance

13 DELAIS DES DIFFERENTES METHODES DE CULTURE P. Idigora et coll
DELAIS DES DIFFERENTES METHODES DE CULTURE P.Idigora et coll. Eu J Clin Microbiol infect Dis :350-4 METHODES M+ (Jour) M- (Jour) M+ et M- (J) Bactec MGIT 960 11 16.1 12.7 L.Jensen 21.4 26.7 22.8 Coletsos 21.3 26.8 22.7 Middelb. 7H11 10.4 20.7 13 L.J+Colet+7H11 12.2 23.3 15.5

14 DELAIS MOYENS DES METHODES CLASSIQUES
Microscopie + Microscopie - L.J 4 tubes = 2,6 € Culture 20j 30j ID + ATB j 60j Liquide +Automate 1 tube = 4,5 € 10j 15j ID+ ATB j 24j

15 Diagnostic de la tuberculose Identification des Mycobactéries
Prélèvement Fluidification - Décontamination Culot de centrifugation M+ Identification par PCR 8 H Milieux liquides Respirométrie Milieu solide  3 à 6 sem.  1 à 4 sem. Identification Par Sondes 2 H Identification biochimique 3 sem. Identification par PCR 8 H Antibiogramme 3 à 4 sem.

16 Identification moléculaire
sans PCR, sondes d’hybridation pour culture Accuprobe® (Gen-Probe) : ARN ribosomal M.Tb complex, MAC, M.kansasii, M.gordonae avec PCR, sur prélèvement M+ et sur culture INNO-LiPA™ Mycobacteria (Innogenetics) : spacer 16s-23s : 16 espèces (dont Mtb complex) Genotype™ CM/AS (Hain Lifescience) : 23s gene : 31 espèces (dont Mtb complex) Genotype ™ MTBC (Hain Lifescience), multiplex PCR: 23s, RD1, gyrB : différentiation Mtb complex

17 INNO-LiPA Mycobacteria
1. M. tuberculosis 2. M. kansasii (I) 3. M. kansasii (II) 4. M. kansasii (III-V) 5. M. xenopi 6. M. gordonae 7. M. avium 8. M. intracellulare 9. M. scrofulaceum 10. MAIS 11. M. chelonae (I-IV) 12. M. chelonae (III) 13. M. chelonae (I) 14. Pas de Mycobacterium 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Conj. Control- MYC- MTB- MKA-1- MKA-2- MKA-3- MXE- MGO- MAIS- MAV- MIN- MSC- MCH-1- MCH-2- MCH-3-

18 Diagnostic de la tuberculose Détermination de la sensibilité aux antituberculeux
Détermination par PCR de la résistance RMP et INH 8 H Prélèvement Fluidification - Décontamination Culot de centrifugation Milieu solide Milieux liquides  3 à 6 sem.  1 à 4 sem. MODS Culture + ATBgramme Identification biochimique 3 sem. Antibiogramme liquide 2 sem. Détermination de la résistance par PCR Antibiogramme 3 à 4 sem.

19 Culture et Antibiogramme
Microscopic Observation Drug Susceptibility (MODS) 12 puits/échantillon dont 8 puits antibiotiques Sachet fermé Étuve CO2 Examen microscopique journalier microscope à inversion de phase Sensibilité de la culture, délai médian = 7 jours Concordance 100% RMP et 97%INH Moore D. et al NEJM 2006, Shiferaw et al JCM 2007 Caws et al, PloS ONE 2007,

20 Culture et Antibiogramme
NRA Nitrate reduction assay Culture en milieu solide + Antibiogramme / colorimétrique Musa et al JCM 2005 Détection de la résistance à la rifampicine Culture en milieu liquide Sel de tétrazolium Abate et al JCM 2004

21 Détection de mutations
PCR Multiplex, prélèvement M+ et culture INNO-LiPA™ Rif TB (Innogenetics) : Rifampicine Rifampicine : Gène rpoB + Mtb complex MTBDR™ (Hain Lifescience) : Rifampicine + Isoniazide Gène rpoB et gène katG + Mtb complex MTBDR plus ™ (Hain Lifescience), multiplex PCR: Gène rpoB et gène katG + gène inhA + Mtb complex Line Probe Assay (PCR) : fluoroquinolones Gène gyrA Giannoni et al AAC 2005

22 Screening de la région hotspot du Gène rpoB MTBDR™ plus Hain Lifesciences
WT1 WT6 WT5 WT4 WT3 WT2 WT7 WT8 505 516 526 531 rpoB MUT2A (H526Y) rpoB MUT2B (H526D) rpoB MUT1 (D516V) rpoB MUT3 (S531L)

23 MTBDR™ plus Wild type rpoB Mutants WT katG inhA Mutants Mutants

24 MTBDR plus™ (Hain Lifescience)
Origine RMP R INH bas niveau haut niveau Causse et al Int J Tuberc lung Dis 18 M+ /41 souches 100% (36) 94,6% (37) NA Hilleman et al JCM 2007 72 M+ /125 souches 98,7% (106) 91% (116) Lacoma et al JCM 2008 65 éch /62 souches 98,3% (51) 79% 63% (27) 86% (21)

25 ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE Communiqué de presse OMS/21 30 juin 2008
Des tests rapides pour la tuberculose a bacilles résistants vont être disponibles dans les pays en développement Azerbaïdjan, Bangladesh, Côte d'Ivoire, Ethiopie, Géorgie, Indonésie, Kazakhstan, Kirghizistan, Lesotho, Moldova, Myanmar, Ouzbékistan, République démocratique du Congo, Tadjikistan, Ukraine et Viet Nam.