Principes d’Immuno-histo-chimie et d’Immunofluorescence :

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1 Principes d’Immuno-histo-chimie et d’Immunofluorescence :
(P. Levillain)

2 Principes généraux Mise en évidence d’un constituant cellulaire ou tissulaire par une réaction antigène anticorps On utilise un anticorps connu qui est dirigé contre un antigène que l’on recherche sur la préparation histologique ou cytologique Puis on met en évidence la fixation éventuelle de l’anticorps sur la lame par un chromogène (IHC) ou un fluorochrome (IF)

3 1 - LES ANTICORPS

4 Les anticorps primaires (ou spécifiques)
Ce sont les anticorps utilisés pour mettre en évidence la présence de l’antigène recherché Il en existe deux types : Les AC polyclonaux Les AC monoclonaux

5 ANTICORPS POLYCLONAUX
Production d’anticorps par des animaux hyper-immunisés

6 ANTICORPS MONOCLONAUX
Technique des hybridomes

7 Milieu HAT Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine L’aminoptérine bloque une voie métabolique qui peut être contournée par l’utilisation d’hypoxanthine et de thymidine sauf par les cellules du myélome

8 Anticorps Polyclonaux :
Inconvénients : spécificité relative et variable selon le lot Avantages : 1) coût généralement moins élevé 2) plusieurs épitopes reconnus => marquage plus intense Monoclonaux : - spécificité définie - cette spécificité peut entraîner une moindre sensibilité en cas d’altération des épitopes

9 Antigènes masqués par la fixation
Restauration antigénique Chauffage des coupes histologiques (autocuiseur, bain marie, micro-ondes) Dans une solution acide ou alcaline selon l’anticorps utilisé

10 2 – LA REVELATION DU COMPLEXE ANTIGENE - ANTICORPS
Immunofluorescence

11 Immunofluorescence directe
fluorochrome

12 Immunofluorescence à deux étages
fluorochrome

13 Microscope à fluorescence (épi-illumination)

14 Différents types de fluororochromes

15 Immunofluorescence : Résumé
Fluorochrome Fluorochrome INDIRECTE DIRECTE Cryocut Sérums utilisés Dépôts des sérums sur lames Incubation en chambre humide

16 Immuno-histo-chimie et Immuno-cyto-chimie

17 Anticorps primaire conjugué
péroxydase

18 PAP

19 Autres techniques de révélation

20 Streptavidine biotine

21 Polymères (type Envision)

22 Application (méthode streptavidine-biotine)
Prélèvements pour histologie standard + IFD en congélation Préparation des Coupes En congélation: 3 à 4 microns, +/- fixation acétone, séchage, rinçage En paraffine: lames blanches 4 µm puis déparaffinage manuel bains d’alcool successifs puis démasquage antigénique (auto-cuiseur)

23 Application (méthode streptavidine-biotine)
Technique de révélation classique « streptavidine-biotine-peroxydase » ETAPES TEMPS D’INCUBATION Agent bloquant les enzymes endogènes : H2O2 3% 5 min Anticorps primaire : 1 Variable : de une heure à une nuit Réactif secondaire biotinylé (Linker) : 2 15 min Streptadidine-peroxydase Substrat ( DAB) : 3 5min Hématoxyline 3 min

24 Résumé du protocole Anticorps primaire puis AC secondaire biotinylé
Déparaffinage Démasquage Crayon hydrophobe Streptavidine-peroxydase Substrat + DAB Hématoxyline Montage des lames

25 Polymères Technique EnVision : amplification par molécule « porteuse »
ETAPES TEMPS D’INCUBATION Agent bloquant les enzymes endogènes : H2O2 5 min Anticorps primaire (souris ou lapin) Variable : jusqu’à une nuit Polymère marqué à la HRP (peroxydase de raifort) 30 min Substrat-Chromogène 3,3’-diaminobenzidine (DAB+) Contre-coloration à l’Hématoxyline 3 min

26 Résumé polymère (Kit EnVision)
Étape 1 : Blocage des péroxydases endogènes Étape 2 : Anticorps primaire Étape 5 : Contre coloration à l’hématoxyline Incubation Étape 3 : Polymère marqué à la HRP Étape 4 : Substrat chromogène

27 Technique du double marquage

28 On doit utiliser deux enzymes différentes
Technique de double marquage en microscopie optique On doit utiliser deux enzymes différentes

29 IM et IHC comparaison Difficultés et limites

30 IF / IHC IMMUNO-FLUORESCENCE :
Avantage : faible coût et technique facile et rapide mais - ne permet pas la conservation des lames - peu informative sur la morphologie IMMUNO-HISTOCHIMIE : - permet d’apprécier la morphologie des lésion - permet la conservation des lames

31 Fixation/Congélation
Type d’antigène Tissu fixé Tissu congelé Ag extra cellulaire +/- + Ag membranaire Svt - Ag intra cellulaire

32 PB = extra cellulaire

33 Vascularite

34 HMB 45 Marqueur des mélanosomes (cytoplasmique)
Chromogène : fast red

35 RP et noyaux

36 Difficultés liées à la technique
Fluorescence : - découplage du fluorochrome (bruit de fond) (=> diminution bruit de fond par Bleu Evans) - fluorescence spontanée (f. élastiques, glandes sudorales…) - fixation sur des protéines d’origine sérique (lupus) - fixation par des protéines électronégatives (donc tamponner en pH alcalin, bloquer les sites) - « fading » (conservation au froid et obscurité, lecture rapide, montage en milieu alcalin et glycériné)

37 Difficultés liées à la technique
IHC : - peroxydases endogènes - biotines endogènes - zones de nécrose - absorption passive (histiocytes)

38 Difficulté non liée à la technique
un antigène peut posséder un ou plusieurs épitopes en commun avec un autre Ag (réactions croisées) CD 10 (cALLA) et cellules du rein CD 56 (NCAM) cellules NK et tumeurs neuroendocrines