Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Dissociation en phase gazeuse de complexes non- covalents: un outil pour l'étude de la reconnaissance.

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1 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Dissociation en phase gazeuse de complexes non- covalents: un outil pour l'étude de la reconnaissance moléculaire. Réalités et espoirs. Valérie Gabelica, Frédéric Rosu, Nives Galic, Edwin De Pauw Université de Liège (Belgique)

2 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Les interactions non covalentes Ponts salins Liaisons Hydrogène Dipole-Dipole Dipole-Dipole induit Interactions « hydrophobes »

3 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Comment produire ces espèces « fragiles » en phase gazeuse 1/T Ln k Désorption dions Décomposition

4 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Les sources dions: la source MALDI From Leonid V. Zhigilei web site From Finnigan

5 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Source Electrospray Concentration: 10 -6 – 10 -3 M Solvent: H 2 O (+ MeOH, CH 3 CN) Cone de Taylor Les sources dions: lélectrospray

6 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Manipulation des ions Activation par collisions MS/MS MS2MS1 Régimes dactivation: haute énergie: keV (secteurs) Basse énergie: quadrupôles Slow heating: pièges à ions !!! Source CID!!!

7 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 (AB) + E 0 (2) ErEr E 0 (1) E internal Reaction coordinate A + + B [Ligand + Substrat] Ligand + Substrat [E(A + ) + E(B)] – E(AB + ) = E 0 - E r On mesure la STABILITE CINETIQUE ou LABILITE Les dissociations unimoléculaires k uni

8 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 RRKM RRK Les calculs sont difficiles pour les systèmes à grand nombre de degrés de liberté Peut-on toujours appliquer les modèles statistiques ? Comment obtenir la distribution dénergie interne ? Lactivation collisionnelle des systèmes à grand nombre datomes est mal connue Constantes de vitesse statistiques

9 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Les spectromètres de masse Le QTOF (MS 2 )

10 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Temps dactivation: 3 ms to 10 s Les spectromètres de masse Le piège à ions (MS n )

11 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Exemples Duplexes DNA Complexes Duplexes-Ligands Complexes cyclodextrine-ligands Complexes Proteine(s)-Proteine(s)

12 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Les duplexes ADN T A C G On peut calculer lénergie dinteraction sur base dun modèles de proches voisins: nombre de liaisons H CG:3 AT:2 stacking

13 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Lévolution des duplexes DNA Dissociation Fragmentations B B

14 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Les duplexes DNA et leurs complexes Ligands du petit sillon Intercalants

15 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 quadrupole (t 1-10 µs) piège à ions (t = 30 ms) Duplex: d(CGCGAATTCGCG) 2 Les duplexes DNA: dissociation ou fragmentation ?

16 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Comparaison entre duplexes dénergie dinteraction croissante

17 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Compétition dissociation-fragmentation

18 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Origine de linfluence du régime de collisions Chauffage lent Activation rapide S - + + -

19 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Maintien de la structure en double hélice en phase gazeuse 5-AAATCGCGGCGCTAAA-3 3-TTTAGCGCCGCGATTT-5 H n-n = -136.8 kcal mol -1 5-GGGCTATAATATCGGG-3 3-CCCGATATTATAGCCC-5 H n-n = -125.3 kcal mol -1 5-AGACTGTGAGTCAGTG-3 3-TCTGACACTCAGTCAC-5 H n-n = -122.6 kcal mol -1 5-GGGCTTTTAAAACGGG-3 3-CCCGAAAATTTTGCCC-5 H n-n = -135.9 kcal mol -1

20 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Minor groove binders Complexes Duplexes-drogues ligands du petit sillon 1:1 complex 2:1 complex ou Intercalation « random » entre les paires de bases Intercalatants

21 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Complexes 5- avec ligands du petit sillon Complexes 5- avec intercalants (GC+H) 5- C 2- G 3- Hoechst (NR 3 H + ) 30 eV (GC+N) 5- C 2- (G+N) 3- Netropsin (NR 4 + ) 30 eV (GC+A) 5- (GC) 5- Amsacrine (neutral ) 12 eV Ethidium (NR 4 + ) 25 eV (GC+E) 5- G 3- C 3- (G+E) 3- C 2- (C+E) 2- MS/MS pour la détermination rapide du mode de complexation

22 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Changement de conformation Contribution entropique et enthalpique (contribution à H >0, S > 0) Transfert hydrophobe Contribution entropique ( S < 0) Création de liaisons intermoleculaires Effet enthalpique ( H < 0) Contribution de lintercalation à lénergie libre de liaison

23 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Daunorubicin (R = H) Doxorubicin (R = OH) ds+D 5- ds 5- R = OH R = H Stabilité cinétique relative des intercalants (1) Spectres MS/MS dans des conditions identiques

24 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Intercalants: intercalation « random » Stabilité cinétique relative des intercalants (2) Cryptolepine Neocryptolepine ds+C 5- ds+NeoC 5-

25 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Comportement en solution Titrages, mesure des constantes de stabilité ou expériences de compétition

26 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Spécificité des complexes en solution vs stabilité cinétique en phase gazeuse (ds+C) 5- (ds) 5- (ds) 4 - (ds+2C) 5- (ds) 5- (ds+neoC) 5- (ds+neoC) 4- (ds+C) 4- (ds) 4- (ds+2C) 4- En solution: ESI full scan duplex 5- (duplex+C) 5- (duplex+neoC) 5- duplex 5- En phase gazeuse MS/MSSpecificité de séquence

27 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Détermination de la cible biologique (FP+neoC) + (FP) + (FP-O-FP) + (FP-O-FP+ C ) + (FP-FP+neoC) + (FP-O-FP) + (FP-FP) + Complexe hème-cryptolepine Complexe hème-neocryptolepine. Le mode de fixation est différent

28 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Interactions hydrophobes fortes dans leau Plus longues sont les chaînes, plus forts les complexes Lélectrospray peut-il produire des complexes spécifiques? COO – CH 2 n COO – Conformation in solution Les complexes de cyclodextrines

29 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Complexes 2- Linformation reste-elle spécifique en phase gazeuse ? Complexes 1- Taux de survie

30 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Influence de la forme des ions From Clemmers web site

31 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Exemples de fragmentation « shape dependant » Résultats du groupe de D. Clemmer

32 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Energie 1-mer7-mer14-mer Nombreuses applications aux complexes multiproteines Deduction de la symétrie des complexes: GroEL Topologie des complexes par MS/MS (C. Robinson, Current opinion in biology, 1999)

33 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 Hot topics Mesures de vitesse d échange H/D (S.R. Kass, JASMS, sous presee) ECD et analyse du maintien des liaisons non covalentes durant la fragmentation (R. Zubarev Rapid Comm. Mass Spectrom. 2001; 15 (19) : 1849-1854.) Dissociation avec répartition inégale des charges (J.S. Klassen, Anal. Chem, 2001, 73, 4647-4661)

34 Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 oDe la conformation des ions produits oDe lénergie transférée lors des collisions (source CID ou MS/MS) oDes déplacements cinétiques qui peuvent être importants oDe la contribution entropique oDe la validité des théories statistiques La spectrométrie de masse et la MS/MS sont utilisées dans le cas de complexes de plus en plus « gros ». Si, dans les cas favorables, les complexes semblent transportés « intacts » et de manière quantitative en phase gazeuse (MS simple), on ne connaît quasi rien: Conclusions: nouvelles questions