Méthodes par coloration

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1 Intérêts de l’immunofluoresence et des méthodes moléculaires pour le diagnostic de pneumocystose

2 Méthodes par coloration
MGG calcofluor Gomori-Grocott bleu de toluidine En particulier avec les prélèvements « pauvres » : expectorations ou patients non sidéens

3 Immunofluorescence Lim, Applied microbiology , 1974
- 108 ech patients immunodéprimés clinique/radio suggérant PCP crachats induits ou aspirations tracheales IFD : Ac obtenus chez le lapin Clinique et/ou radio Nbre patients avec IFD + - total Très en faveur de PCP 25 10 35 Suggestifs de PCP 8 3 Négatifs (contrôles) 47 50

4 (methenamine-silver sur biopsie)
Immunofluorescence Lim, Applied microbiology , 1974 Histologie (methenamine-silver sur biopsie) Nbre patients avec IFD + - total 9 2 4 6 11 15

5 Immunofluorescence Lim, Applied microbiology , 1974
bonne spécificité de la technique : pas de confusion possible gain de sensibilité p/t à la méthode de référence de l’époque ? (anapath.)

6 Immunofluorescence Milder, J. Clin. Microbiol. , 1980
rats immunodéprimés par injections sc de cortisone 2/semaines. sacrifice de 4 rats toutes les semaines * biopsie de poumon : Gomori-Grocott * LBA : Giemsa et IFI (Ac obtenus chez le lapin)

7 Immunofluorescence Milder, J. Clin. Microbiol. , 1980

8 Immunofluorescence Milder, J. Clin. Microbiol. , 1980
au moins aussi sensible que l’histologie pour le diagnostic très précoce de l’infection. sensibilité très supérieure au Giemsa sur LBA pas de problème de spécificité.

9 Immunofluorescence Procop, J. Clin. Microbiol 2004
313 échantillons examinés (LBA ++). Diff-Quick, Gomori-Grocott, Calcofluor, Merifluor White® (IFD) - echantillon considéré + si positif avec 2 techniques au moins. technique Sensibilité Spécificité VPP VPN Diff-Quick 48.4 99.6 96.9 88.0 Calcofluor 73.8 98.0 93.4 Gomori 76.9 99.2 96.2 94.2 IFD 90.8 94.7 81.9 97.5

10 Immunofluorescence Wolfson, J. Clin Microbiol, 1990 148 ech
double aveugle IFD : 100% Giemsa : 65% Aslanzadeh, Infection, 1996 168 ech CW : 57% Ng J. Clin Microbiol, 1990 182 ech (VIH ou « à risque ») IFI : 90 % DQ : 73 % Gomori : 72% Bleu toluidine : 71 % 163 ech IFD : 97 % DQ : 90 % Halford, Cytopathology, 1994 384 ech IFD : 86 % Gomori-Grocott : 66 %

11 Immunofluorescence Elvin, BMJ, 1988 (abstract) 25 LBA VIH+ 43 IS VIH+
IFI : 19 + Gomori-Grocott : 17+ IF > Gomori Rigole, Pathol. Biol (abstract) 100 LBA ID IFD : 72 + Gomori-Grocott : 68 + Tuncer, Scand J Infect Dis (abstract) 30 IS ID IF : 8 + Giemsa et Gomori : 4 +

12 Immunofluorescence Lautenschlager, J Clin Microbiol, 1996 553 LBA ID
IF : 86% Gomori-grocott : 81%

13 Immunofluorescence Aslanzadeh, Infection, 1996 :
- 168 prélèvements respiratoires dont 58% VIH - IFD : 19+ dont 12 crachats, 1 crachat induit et 6 LBA (100%) CFW : 11+ dont 6 crachats et 5 LBA (57%) Gain de sensibilité avec l’IF notamment pour les expectorations.

14 Immunofluorescence Cruciani Eur Respir J. 2002
- méta analyse : comparaison de l’analyse d’un crachat induit par rapport au LBA (« gold standard ») chez les VIH+. - colorations : 43 % IF : 67 % (p<0.001) L’IF est nettement plus sensible pour les crachats induits (VIH+).

15 Immunofluorescence Kovacs, N. Engl. J. Med. 1988 (abstract)
49 crachats induits de patients présentant une PCP (confirmée a posteriori compte tenu des colorations, la clinique, l’évolution sous traitement) IFI : 92 % Bleu de toluidine : 80 % Diff-Quick : 76 %

16 Immunofluorescence Ng J. Clin Microbiol, 1990 182 ech (VIH ou « à risque ») IFI : 90 % DQ : 73 % Gomori : 72% Bleu toluidine : 71 % Evaluation des FP avec l’IFI : 15 patients + uniquement avec IFI  3 patients PCP certaine (réponse au tt anti-Pj)  6 patients indéterminés  6 ont autre cause et n’ont pas été traités pour Pj Evaluation des FN avec toutes les méthodes : 77 patients –  57 Vrais négatifs  10 patients indéterminés  10 Faux négatifs (réponse au tt anti-Pj)

17 Immunofluorescence Méthode Sensibilité Spécificité VPP VPN DQ 72 100
Ng J. Clin Microbiol, 1990 182 ech (VIH ou « à risque ») IFI : 90 % DQ : 73 % Gomori : 72% Bleu toluidine : 71 % Méthode Sensibilité Spécificité VPP VPN DQ 72 100 69 GMS 75 TBO 74 71 IFI 80 90 93

18 Immunofluorescence Méthode Sensibilité Spécificité VPP VPN DQ 70-100
Ng J. Clin Microbiol, 1990 163 ech (VIH ou « à risque ») IFD : 97 % DQ : 90 % Méthode Sensibilité Spécificité VPP VPN DQ 70-100 65-100 IFD 72-100 100-96 100-92 69-100 (Crachats induits – LBA)

19 Immunofluorescence difficulté de conclure en l’absence de « gold standard » IF : bonne sensibilité, a priori supérieure à celle des techniques de coloration classique. Permet de « rattraper » certains cas. Intéressant en particulier pour les expectorationns deux techniques sont indispensables.  FN de toutes les techniques FP de l’IF décrite comme plus rapide d’execution (p/t Gomori) et surtout plus rapide et plus simple à lire. pas de problème de spécificité : Spécificité des Ac monoclonaux, et reconnaissance « facile » des kystes ?

20 Immunofluorescence

21 PCR Une capacité de détection supérieure …
Dilution des LBA : comparaison capacité de détection x 100 p/t Gomori (Ribes, J Clin Microbiol, 1997 ) x 1000 p/t IFD (Leigh et all, J Clin Pathol, 1993)

22 PCR Une capacité de détection supérieure … Brancart,
J Microbiol Methods 2005 (abstract) 53 LBA Giemsa et IFD : 8+ PCR : 24+ Arcenas, Diag Microbiol Infect Dis (abstract) 2006 Gain de sensibilité de 21% Spécificité. Ribes J Clin Microbiol, 1997 129 ech Gomori : 37+ PCR : 60+ Caliendo, J Clin Microbiol, 1998 232 ech Crachats induits : IF : 64 % PCR : 96 % Leibovitz, J Clin Microbiol, 1995 284 ech Crachats induits : Giemsa et GMS : 28 % PCR : 85 %

23 PCR Une capacité de détection supérieure … IF : 2+ Khan, PCR : 11+
J Infect, 2000 (abstract) 46 ech IF : 2+ PCR : 11+ nPCR : 21+ Tamburrini J Med Microbiol, 1993 (abstract) 52 LBA IFD : 81% PCR : 100%

24 PCR Une capacité de détection supérieure … … pas toujours … Caliendo,
J Clin Microbiol, 1998 232 ech LBA : IF et PCR : 100 % Leibovitz, J Clin Microbiol, 1995 284 ech LBA : Giemsa et GMS : 82 % PCR : 86 %

25 PCR Pourquoi PCR pas toujours à 100 % ?
Un certain nombre de Faux Neg de la PCR sont post-traitement. Leigh et all, J Clin Pathol, 1993 Mauvaise extraction de l’ADN Toutes les methodes ne se valent pas … (Lu, J Clin Microbiol, 1995) sensibilité de 6 méthodes PCR : 100%, 100%, 57%, 60%, 33%, 23%

26 PCR Une trop grande sensibilité ?? Olsson,
Clin Microbiol Infect, 2001 91 ech IF : sens 60% spé 97% VPP 88% VPN 86% PCR : sens 96% spe 59% VPP 52% VPN 100%

27 PCR (Maskell, Thorax, 2003 ; Medrano, Emerg Infect Dis, 2005 ;
Il existe un portage sain … Chez l’immunodéprimé : 18% (Maskell, Thorax, 2003) Chez l’immunocompétent : 12 à 20% (Maskell, Thorax, 2003 ; Medrano, Emerg Infect Dis, 2005 ; Sing, J Clin Microbiol, 2000) Pas toujours retrouvé : 0% (Nevez, Clin Infect Dis, 2005 ; Weig, J Clin Microbiol, 1997)

28 PCR Comment distinguer le portage de l’infection par P. jiroveci ?
Flori, J Med Microbiol, 2004 173 LBA de patients présentant des signes évoquant PCP « Gold standard » : clinique, épreuve thérapeutique … sensibilité spécificité VPP VPN Giemsa Gomori 60 100 92 PCR RT PCR 85 21

29 PCR Comment distinguer le portage de l’infection par P. jiroveci ?
Flori, J Med Microbiol, 2004 Détermination de la concentration en ADN dans l’échantillon : La PCR en temps réel, en permettant la quantification de l’ADN de l’échantillon pourrait permettre un diagnostic biologique fiable .

30 PCR  Les méthodes moléculaires ne sont pas à l’heure actuelle de bonnes méthodes pour le diagnostic de la PCP : trop de faux positifs dus à une trop grande capacité de détection.  autres utilisation possible : épidémio, screening des patients pouvant bénéficier d’une prophylaxie, suivi de l’efficacité du tt …