Interaction de Neisseria meningitidis avec l’endothelium :

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1 Interaction de Neisseria meningitidis avec l’endothelium :
Un rôle du récepteur béta-2-adrénergique ?

2 Interaction Neisseria meningitidis et cellules endothéliales
? Résistance au flux Internalisation ? Ezrine recrutée et phosphorylée Microvillosités Polymerisation d’actine ? ? Rho Cdc 42

3 Formation des microvillosités
Eugene, J Cell Sci 2002

4 Nck interacting kinase
Recrutement et activation de l’ezrine PIP2 P Rho kinase PKCα Nck interacting kinase PIP2 Bretscher, Nat Rev Cell Biol 2002

5 Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005  Induction de ruffles par l’Ach. Ces ruffles sont riches en ERM phosphorylée

6 Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005 Insister si pas ezrin : pas de ruffle  L’induction des ruffles par Ach nécessite l’ezrine

7 Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrine

8 Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005 1-586 : ezrine complète / : manque domaine Cterm de phosphorylation / T567A : mutation site de tyrosine phosphorylation  GRK2 est capable de phosphoryler l’ezrine sur son site « habituel » d’activation in vitro.  Cette phosphorylation est dépendante de la présence de PIP2 et de G : nécessité activation récepteur ?

9 Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005 Dominant négatif GRK2 GRK2 sans activité kinase GRK2 non recrutable GRK2-CT : dominant négatif / K220R=GRK2 sans activté kinase / GRK2-RH : GRK2 non recrutable au récepteur / GRK2-mRH : mutation de GRK2-RH, recrutable au R Le ruffling induit par ACh dépendant de GRK2 et de la phosphorylation de l’ezrine

10 Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005 Induction de l’endocytose du récepteur 2 adrénergique par l’isprotérénol (agoniste). Cette endocytose est connue pour être dépendante de l’actine.  Il existe une colocalisation avec les pERM

11 Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005  L’endocytose du β2-AR induit par un agoniste, phénomène dépendant de l’actine, nécessite l’ezrine. Quantification B2R à la surface des cell par FACS : Cellules normales / dominant négatif dynamin (connue empêchant l’endocytose) / dominant négatif ezrin cellules traitées par agoniste 30 minutes cellules traitées par agoniste 30 minutes puis antagoniste 30 minutes

12 Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrine
 rôle possible des GPCR dans les modifications du cytosquelette d’actine  rôle possible des GPCR dans la phosphorylation de l’ezrine via GRK2  certains GPCR sont endocytés après fixation de l’agoniste, dans un processus nécessitant l’ezrine et la polymerisation d’actine. Existe-t-il un lien entre la formation de la plaque corticale induite par Nm et un GPCR ?

13 Il existe un recrutement de GPCR au niveau de la plaque corticale
Β2-adrenergic R CCR5 ATI-R CXCR4

14 L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe le recrutement d’ezrine
Ezrin recruitment 0% 20% 40% 60% 80% 100% control Iso SDF1 MIP1β IL8 AT2 5 à10 x Kd % of recruiting colony β-agonist Ct 0,0001 0,01 1 10 Ezrin recruitment Isoproterenol (μM) 0% 20% 40% 60% 80% 100% % of recruiting colony

15 L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe le recrutement d’ezrine
- 10µM 10µM 1µM 1µM Ezrin recruitment 0% 20% 40% 60% 80% 100% Isoproterenol Propranolol % of recruiting colony  Cet effet est bien du à l’action spécifique de l’isoprotérénol sur son récepteur 2AR

16 L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe le recrutement d’ezrine
20 40 60 80 100 % of recruiting colony Ezrin recruitment Control Propranolol 10 uM β-antagonist  Nm n’interagit pas avec le site actif du 2AR

17 L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe le recrutement d’ezrine
20 40 60 80 100 Control PKA-PS 20uM 10uM Forkolin 10-5 M 10-6 M Ezrin recruitment % of recruiting colony  Le recrutement d’ezrine induit par l’interaction Nm/2AR n’est pas dépendant de la voie des protéines G

18 Il existe une deuxième voie de transduction du signal 2adrénergique

19 Il existe une deuxième voie de transduction du signal 2adrénergique
Lefkowitz, Science 2005

20 Il existe une deuxième voie de transduction du signal 2adrénergique
Beta-arrestin2-GFP ezrin GRK2-GFP ezrin Ezrin recruitment 0% 20% 40% 60% 80% 100% Control siRNA Arrestin 1+2 sirRNA FLNA sirRNA GRK2 sirRNA Ezrin

21 Nm, 2AR et microvillosités
2C43-GFP 30 min 90 min 150 min 210 min 270 min 2C43-GFP + isoproterenol

22 Nm, 2AR et microvillosités
+ iso :

23 A court terme … * séquence de recrutement des GPCR * si RNA 2AR * vérifier l’activation de 2AR (voie des protéines G) * screening des GRK impliqués