Quantification sanguine du cytomégalovirus humain

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1 Quantification sanguine du cytomégalovirus humain
XIXème Colloque de Virologie de Versailles Alexandra Ducancelle Département des Agents Infectieux CHU Angers

2 Le cytomégalovirus Famille des Herpesviridae Virus ubiquitaire
1ère cause des infections virales congénitales Infections sévères chez les patients immunodéprimés Receveur d’allogreffe Patient infecté par le VIH Le CMV appartient à la famille des HV Est un virus ubiqyuitaire Les infections à CMV sont la 1ère cause des infections virales congénitales et peuvent mettre en jeu le pronostic fonctionnel ou vital es patients ID Particule virale en ME

3 Physiopathologie Primo-infection Virémie Diffusion Organes cibles
Excrétion virale intermittente Latence Au cours de la primoinfection, le virus dissémine par voie sanguine (virémie) pour atteindre ses organes cibles. Au cours de cette phase, les cellules endothéliales et les mono-macro jouent un rôle majeur de la diffusion du virus. S’installe ensuite une infection latente dans les monocytes macrophages qui vont pouvoir relarguer des particules virales du CMV infectieuses lors d’une ID ou dans un contexte allogénique. Sous l’effet d’une immunodépression, des infections secondaires par réactivation du virus endogène ou par réinfection par une nouvelle souche exogène peuvent survenir. Ces infections secondaires vont provoquer des phases de virémie Réinfection Endogène: Réactivation Réinfection exogène Immunodépression Stimulation allogénique

4 Physiopathologie Réplication virale du CMV Processus dynamique in vivo
Temps de doublement de la population virale in vivo = 1 jour Apparition des marqueurs d’infection active : antigénémie, virémie, ADNémie, ARNémie La réplication du CMV est un processus dynamique avec un tps de …… Cette réplication virale va faire apparaître des marqueurs d’infection active dans plus de 85% des patients à risque de développer une M à CMV Emery et al (1999) J Exp Med 190: Sia et al (2000) J Infect Dis 181: Humar et al (2002) J Infect Dis 186: Razonable et al (2003) J Infect Dis 187:1801-8

5 Physiopathologie Chez les receveurs d’allogreffe Conséquence clinique
Marqueurs d’infection active Conséquence clinique Infection à CMV Maladie à CMV Conséquence thérapeutique Initiation d’un traitement anticipé (dit préemptif) Chez les receveurs d’allogreffe, l’apparition des marqueurs a deux conséquences clinique : ils signent le début d’une infection à CMV qui va pouvoir évoluer vers une M à CMV : forme grave de l’infection à CMV avec des localisations viscérales Thérapeutique : ces marqueurs vont être à l’initiation d’un trt anticipé pour éviter l’apparition d’une maladie à CMV Receveurs d’allogreffe de moelle ou d’organe Infection à CMV : Patient asymptomatique Signes biologiques d’infection active à CMV Maladie à CMV Patient symptomatique (fièvre…) Et/ou localisation viscérale

6 Méthodes de quantification du CMV
Non moléculaires Antigénémie pp65 Moléculaires Moléculaires PCR conventionnelle : Amplicor Monitor® (COBAS, Roche) PCR temps réel : Techniques maison Trousses commercialisées (Argène Biosoft, Qiagen, Abbott….) NASBA : Trousse Nuclisens pp67® test (Organon tecknika) Biomérieux Hybridation moléculaire Hybrid Capture DNA Assay ® (Digene) Les méthodes de quantification du CMV reposent sur des méthodes non moléculaires comme l’ag qui consiste à mettre en évidence la phosphoprotéine pp65 dans le noyau des leucocytes Parmi les méthodes moléculaires de quantification du CMV, la détection du génome viral est réalisé par différentes techniques - amplification de l’ADN viral avec détection des amplicons en point final : Amplification de l’ADN viral par des techniques de PCR temps réel (De nombreux protocoles maisons ainsi s=que des trousses commercialisées sont disponibles) - détection des transcrits ARNm très précoce ou tardif (pp67 (pUL65) par NASBA Détection de l’ADN viral par hybridation moléculaire Parmi les méthodes non moléculaires de quantification du CMV, la recherche d’un virémie en culture classique ou rapide ne sont pas recommandées pour la quantification du viruus. Elles ont une sensibilité plus faible que l’agPP65 En revanche, l’agpp65 présente l’avantage d’une méthode rapide, l’existence de trousses commercialisées standardisées mais le prélèvement doit être rapidement acheminé au labo Processing time < 6 heures Expérience pour la technique PCR = Polymerase chain reaction NASBA = Nucleic acid sequence-based amplification

7 Méthodes de quantification du CMV
Méthodes moléculaires Méthodes Délai de résultat Seuil/ Cible virale Avantages Inconvénients Amplicor CMV Monitor heures Cible : gène ADN polymérase virale Seuil de détection : 400 copies/ml de plasma ou 5x105 leucocytes Grande sensibilité Risque de contamination Linéarité de 400 à 1x105 copies Hybrid Capture DNA assay 6 heures 700 copies/ml de sang 2,1 pg d’ADN Linéarité : 700 à 2x106 copies/ml de sang ou 830 pg d’ADN Pas de contamination Facilité d’utilisation sensibilité par rapport à l’agpp65 et PCR ? Nuclisens CMV pp67 700 molécules d’ARN Non quantitatif Parmi les méthodes moléculaires, la technique Amplicor monitor permet de détecter l’ADN viral dans le plasma ou dans les leucocytes avec un seuil de S de 400: non recommandé par le FDA Nuclisens : approuvée Hybrid : oui en qualitatif

8 Méthodes de quantification du CMV
Méthodes moléculaires Méthodes Prélèvement/cible Seuil et amplitude de détection extraction amplification CMV R-gene kit ™ (argene) Kit 50 réactions Sang total Cible : gène UL83 codant la pp65 Seuil de détection : 1 copie/µl Standard : 2500 à 2,5 millions de copies Automatisée (biorobot, MagNAPure, Easy Mag) Manuelle Smart cycler ® LightCycler ® ABI PRISM® RotorGene ® CMV RUO PCR Kit™ (Abbott ) Plasma Sérum Cible : gène UL83 Seuil de détection : 0,2 copies/µl (50 copies/ml) Standard : copies/µl Automatisée : m1000 (Abbott) Manuelle :QIAamp™ DNA Mini Kit (Qiagen), PureArt™ DNA Mini Kit (artus) ABI PRISM® 7000, m1000 ®, Abbott artus™ (Qiagen) Kit réactions Cible : région 105pb Seuil de détection : 0,2 à 0,4 copies/µl Automatisée (biorobot) Manuelle:QIAamp™ DNA Mini Kit (Qiagen), LightCycler® artus 3000™ / Rotor-Gene™ Les techniques de PCR tps réel actuellement disponibles présentent de nombreux avantages par rapport à la technique de PCR conventionnelle réduction du délai de rendu des résultats à 3 heures extraction diminution les risques de contamination post-PCR, diminution du seuil de détection (entre 50 à 100 copies/ml). Les cibles virales utilisées sont la PP65, gène très précoce, gb permettent de quantifier le CMV sur sang total, plasma oui sérum.

9 INTERETS DE LA QUANTIFICATION

10 Intérêts de la quantification
2 questions se posent Pourquoi quantifier ? Par quelles méthodes ?

11 Indications de la quantification
Rôle des marqueurs de réplication virale pour : Distinguer infection active et infection latente Identifier les patients à haut risque de développer une maladie à CMV Dépister une infection active avant l’apparition de tout symptôme clinique Diagnostiquer une maladie à CMV Pour surveiller l’efficacité d’un traitement

12 Cinétique de réplication virale
Charge virale CMV 1.0 0.8 Probabilité maladie à CMV 0.6 0.4 De nombreuses études ont montré que la quantification sanguine du CMV permettait de prédire l’évolution vers une maladie à CMV et que des charges virales élevées dans le sang étaient corrélées à un risque plus élevé de la maladie à CMV 0.2 0.0 3 4 5 6 7 Charge Virale (log genomes/ml) Cope et al (1997) J Infect Dis 176:

13 Cinétique de réplication virale
Marqueurs de la réplication virale sont prédictifs d’un risque de maladie à CMV: le niveau de la charge virale CMV après la greffe la vitesse d’augmentation de la charge virale CMV entre deux prelèvements consécutifs Certains marqueurs de réplication sont prédictifs de l’apparition de la maladie à CMV une CV élevée CV initiale après transplantation. Vitesse de réplication Pic de CV survient souvent trop tardivement pour fournir une information pronostique Emery et al (2000) Lancet 355: Norris et al (2002) Transplantation 74: Razonable et al (2003) J Infect Dis 187:1801-8

14 Cinétique de réplication virale
1,6 1,4 0.9 1,2 0.8 Vitesse d’augmentation de la charge virale (log genomes/ml sang) 1,0 0.7 0.6 0,8 0.4 0.5 0,6 0.3 0.2 0,4 D’autres facteurs liés à la dynamique de la de réplication du CMV sont impliqués dans l’évolution vers une maladie à CMV comme une CV initiale élevée et surtout la vitesse de réplication du virus C’est ainsi que L’équipe d’Emery a élaboré un modèle mathématique qui permet de prédire le risque d’apparition de la maladie à CMV en fonction de la CV initiale et de la vitesse d’augmentation. Rythme d’augmentation de la CV : 0,33 log10 genomes/ml de sang total par jour  maladie à CMV 0, 19 log10 genomes/ml de sang total par jour  indemne 0.1 0,2 0,0 3 4 5 6 7 Charge virale Initiale CMV (log genomes/ml sang) Emery et al (2000) Lancet 355:

15 Cinétique de réplication virale
Quantification de la charge virale CMV dans les leucocytes (PBL) chez 47 transplantés de cœur et foie par technique Cobas Amplicor Monitor Charge virale CMV log10 copies/106 PBL (moy±SD) 1ère PCR positive Semaine 4 Semaine 5 Semaine 6 Patients symptomatiques (n=30) 3 (3±0,6) a 4 (3,7 ±0,6)b 4,3 (4,2 ±0,4) c 4,4 (4,4 ±O,3) d Patients asymptomatiques (n=17) 2,7 (2,7 ±0,4) a 2,8 (2,8 ±0,5) b 3,4 (3,2 ±0,6) c 3,6 (3,7± 0,3) d Récemment, une étude sur la dynamique de la réplication du CMV a été réalisée chez 47 transplantés (foie et cœur). Parmi ces patients 30 (64%)ont développé une maladie à CMV et 17 patients sont restés AS dans les 6 1er mois après la greffe Les auteurs ont réalisés un suivi virologique hebdomadaire par une quantification de la CV du CMV pendant les 6 1er mois qui ont suivi la greffe.. Ils ont montré une différence significative de CV entre les 2 groupes de patients à partir de la semaine 4 Avec dans le groupe de patients S : une augmentation sup ou = à 1 log /106 leuco entre 1er PCR + et W4 : pour ceux qui développent une M à CMV Alors que dans le groupe de patients AS : cette différence est < 1 log Quantitation of cytomegalovirus DNA by the polymerase chain reaction as a predictor of disease in solid organ transplantation. V. Ghisetti et al. Journal of medical Virology (2004) Maladie à CMV : 30 sur 47 = 64% des patients ( 8 PI R-/D+ et 22 reinfection R+/D+ CMV DNA + = J23 post-greffe S4 : 1er point pour lequel ils ont observé une différence significative de CV entre les patients S et non S Entre 1er PCR + et W4 : augmentation sup ou = à 1 log /106 leuco pour ceux qui développent une M à CMV < 1 log pour les autres a : non significatif b : p< 0,0001; c : p = 0, 006; d : p<0,0001 V. Ghisetti et al. Journal of medical Virology (2004)

16 Intérêts de la quantification
2 questions se posent Pourquoi quantifier? Par quelles méthodes ? Valeur de l’agpp65 dans le diagnostic et la prédiction de la maladie à CMV Corrélation entre l’agpp65, la technique Cobas Amplicor et la PCR temps réel La question principale qui se pose est : antigénémie ou PCR J’ai sélectionné 4 études qui montrent des résultats controversés quant aux performances de ces méthodes dans le diagnostic et la prédiction de la maladie à CMV

17 Intérêts de la quantification
Cohorte de 73 transplantés d’organe (35 foie, 26 rein, 12 cœur) Détermination de l’agpp65 pendant les 6 premiers mois après la greffe (2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 14 et 16) Objectifs : Sensibilité de l’antigénémie dans le diagnostic de la maladie à CMV et dans la prédiction de la maladie à CMV Dans cette étude réalisée chez 73 TO, l’objectif était de valider l’utilisation de l’agpp65 dans le diagnostic de la M à CMV. Dans un premier temps, ils ont quantifier l’agpp65 tous les 15 j pdt les 6 1er mois après la greffe pour calculer les performances techniques du test en terme de sensibilité et de VPP Dans un second temps, ils ont déterminé le seuil de l’agpp65 qui permettait de donner la meilleure VPP et VPN au cours du suivi 13 patients R-/ D+ (17,2%) sur 583 échantillons  109 Agpp65 + (18,7%) chez 37 patients  51% des patients sont antigénémiques Bernabeu-Wittel et al, JID 2005

18 Intérêts de la quantification
Valeur de l’agpp65 dans le diagnostic de la maladie à CMV Valeur de l’agpp65 dans la prédiction de la maladie à CMV Sensibilité Spécificité VPP VPN Agpp65  10 pos/105 leucocytes 86% 65% 51% 92% VPP: valeur prédictive positive VPN : valeur prédictive négative Parmi les 73 patients, 22 patients développent un total de 22 épisodes à CMV (0.3 épisodes /patient) Parmi les 22 patients (19/22 86%) - 19 patients / 37(51%) (1 ou plusieurs agpp65 + > 10noyaux )développent une maladie à CMV 3/ 36 (8%)agpp65 – Ce qui établit la S et la VPP de l’agPP65 dans le diagnostic de la M à CMV à 86% et 51% Ces chiffres sont accord avec d’autres études publiées. En revanche, seuls 10 patients qui ont développé une M à CMV ont une ou plusieurs agpp65 + avant l’apparition des signes cliniques , ce qui établit une S et une VPP à 46 et 42% Risque relatif de M à CMV si agpp65 : 6,19 10/22 patients (45%) : agpp65 + avant les signes cliniques Agpp65 : test commercilisé , anticorps monoclonal Biorad Nbre de noyaux pour leuco Trt anticipé basé sur l’agpp65 Corrélation avec les études : sensibilité comprise entre % VPP comprise entre 51 et 65% Traitement anticipé basé sur PP65  baisse incidence de la maladie à CMV Dans le suivi à long terme, l’ag a une s de 86% mais une VPP basse pour le diagnostic de la M à CMV Dans la prédiction de la M à CMV, la VPP est plus base d’où la faible capacité de l’ag de détecter précocément une activité biologique CMV Sensibilité Spécificité VPP VPN Agpp65  10 pos/105 leucocytes 46% 73% 42% 76% Bernabeu-Wittel et al, JID 2005

19 Intérêts de la quantification
Valeur de l’agpp65 dans la prédiction de la maladie à CMV dans une cohorte de 30 transplantés rénaux Tests leucocytaires Agpp65 bDNA (Bayer) Monitor Amplicor (Cobas Roche) Sensibilité (%) 100 91 Spécificité (%) 63 42 47 VPP (%) 61 50 VPN (%) 90 Ces résultats sont en contradiction avec une étude précédente qui avait montré une senbulité et une VPN élévée des test leucocytaires et notamment de l’agpp65 ( faible effectif et ag + à 1 cellule) Voici une autre étude qui a comparé les performances techniques de l’agpp65 avec les autres test moléculaires . Cette étude a été réalisée chez 30 transplantés rénaux sur un suivi longitudinal de 12 semaines. Les auteurs ont conclu qu’avec un seuil de + de l’agpp65, la S et la VPP de ce test était de 100% 11 patients (36.7%) : symptomatiques;; 7 (23.3%) AS et 12 ( 40%) non infectés 1er agpp65+ : 30 jours 1er symptomes : 37 jours Les plus hautes sensibilités et VPN pour détecter une infection à CMV sont obtenues avec les tests leucocytaires Comparaison des méthodes de détection du CMV pour prédire une maladie à CMV chez les transplantés rénaux Dans cette étude, la meilleure S et VPN pour prédire une M à CMV, et la précocité du test + avant la M sont obtenues avec les tests leucocytaires. La cinétique de agpp65 est corrélée à celle de la CV dans les leucocytes. Même si la spécificité dans le plasma est plus haute que pour les tests leuco, 3 patients AS avaient une CV plasmatique élevée et 3 patients S avaient un eCV plasma faible Plus haute specificté et VPP : plasma et test leucocytaires Persistence de l’AND virale dans les leucocytes sous trt 66< risque de récidive siPCR dans les leuco - pas d’infection active à CMV Pellegrin et al., JID2000

20 Intérêts de la quantification
Message Antigénémie pp65 Méthode sensible pour le diagnostic de l’infection à CMV Valeur de l’antigénémie dans la détection précoce de la maladie à CMV (technique utilisée, seuil de positivité de l’antigénémie)

21 Intérêts de la quantification
32 transplantés de foie Surveillance bi-hebdomadaire pendant les 3 premiers après la greffe, puis tous les 15 jours jusqu’au 6ème mois Traitement anticipé si Agpp65 > 20 cellules positives / leucocytes 20 patients Objectif : comparer les résultats de la quantification du CMV dans les leucocytes par trois méthodes : l’antigénémie, PCR conventionnelle (Amplicor Monitor), PCR temps réel (technologie TaqMan) Je vais maintenant vous présenter 2 études qui ont comparé les résultats de la quantification de la CV CMV par 3 techniques : agpp65, PCR conventionnelle et PCR temps réel La 1ère étude a réalisé une quantification du CMV dans les leucocytes par les 3techniques chez 32 T de foie. 20 patients ont été mis sous trt anticipé avait pour objectif de valider une technique de PCR temps réel pour la quantification du CMV dans le suivi des transplantés et de comparer cette technique avec l’ag et la détection du CMV dans les leucocytes par la technique Roche Les patients étudiés étaient des transplantés de foie (cohorte de 32) et la quantification du CMV par les 3 méthodes a été réalisée selon un rythme bi-hebdomadaire. PCR 3 + en cobas (2,2; 2 et 1,7 log copies/ leucocytes correspondant à agpp65 1; 1 et 2) Corrélation meilleure entre les deux techniques de PCR si agpp65 < 50  biais de la technique quantitative en point final pour les valeurs hautes de CV CV à 3,8 et 3,ç log copies/ chez les patients trt en premptif CV à 3,1 et 2,9 si non trt CV > ou = à 4 log/copies/ 106 leucocytes  haut risque de développer une infection à CMV Avantages du temps réel : moins de contamination et pas de biais de quantification comme dans la PCR conventionnelle 32 transplantés de foie Surveillance bi-hebdomadaire par PCR conventionnelle amplicor monitor) et AgPP65 (PBL) PCR temps réel en 2ème intention( PCR multiplex cible viral : UL123 (IE exon 4) et cible cellulaire : B globin ; extraction 1 million de leuco sonde taqman marquée en Fam, contrôle interne en Vic, standard de quantification externe avec un plasmide UL o copies/réactions) 3 receveurs séro - : PI 29 receveurs séro+ : réinfection ou réactivation Trt preemptif pr du GCV IV pdt 21 jours si Agpp65 > 20 pour (20 patients trt sur les 32) Aucune maladie à CMV développée Allice T, J Med virol 2006

22 Intérêts de la quantification
Résultats de la quantification du CMV Agpp65 (nombre de cellules/2.105 PBL) Cobas Amplicor (log copies/ PBL) Real time PCR (log copies/ PBL) valeurs médianes (moyenne± écart-type) Patients en traitement Anticipé (n=20) 98*(277 ±320) 3,9** (3,9 ±0,2) 3,8*** (3,5 ±1) Patients non Traités (n=12) 2* (5 ±6) 3,1** (3,1 ±0,3) 2,9***(2,8 ±0,8) Ce tableau montre les résultats de la quantification du CMV par les 3 techniques (ag et PCR ) et des CV dans les 2 groupes de patients trt et non trt. Vous pouvez noter que les valeurs de l’agpp65 et des CV sont plus élevées dans le groupe de patioents en trt par rapport au groupe de patienst AS, cette différence est significative pour les 3 techniques ce qui montre une bonne corrélation des résultats pour les 3 techniques. Les auteurs ont montré une différence significative entre les valeurs de l’ag et de la CV dans les 2 groupes à savoir que les valeurs hautes d l’ag ou des CV sont retrouvées pour les patients en trt anticipé  corrélation des résultats entre les deux techniques Antigénémie ou Charge virale initiale  4 log10/ 106 leucocytes corrélée à un risque élevé de maladie à CMV * p= 0,01, ** p< 0,0001, *** p< 0,0001 Allice T et al (2006) J Med Virol, 78:

23 Intérêts de la quantification
Les diagrammes A et B C montre que les résultats de la quantification des CV sont corrélées entre les 3 techniques avec cependant un meilleur coefficient corrélation pour les deux techniques de PCR entre pp65 et les deux techniques de PCR pour les échantillons avec 1 ou plusieurs cellules + . La corrélation entre les deux PCR est meilleure mais la corrélation est plus forte pour les échantillons avec < de 50 cellules + en pp65 (r=0,70) que pour ceux qui ont > 50 cellules + Allice T et al (2006) J Med Virol, 78:

24 Intérêts de la quantification
Agpp65 Real time PCR Cobas Amplicor (nombre de (log copies/ PBL) cellules/2105 PBL) valeurs médianes (moyenne± écart-type) ,6 (2,8 0,8) 2,8 (2,8  O,5) ,0 (2,9 1) 2,9 (2,9  0,5) ,6* (3,  0,7 3,8** (3,7  0,3) ,0* (4,2  0,6) 3,7** (3,6  0,3) ,2 (4,1  0,6) ,9 (3,  0,2) > ,8 (4,7  0,7) 4,0 (3,9  0,5) Ils ont ensuite divisés les patients en 6 groupes selon les résultats de l’ag. Ils ont comparé les valeurs des charges virales avec la technique Roche et la méthode de PCR temps réel pour chacun des groupes. Vous pouvez noter qu’à partir du seuil de 20 cellules positives en ag, il existe une augmentation significative des valeurs de CV en temps réel alors qu’en technique cobas, il y a une progression plus lente pour Cobas Pouvoir discriminatif plus grand du temps réel / à pCR conventionnelle chez les patients infectés * p= 0,01, ** ns  biais de quantification pour les valeurs hautes de charge virale en PCR conventionnelle Allice T et al (2006) J Med Virol, 78:

25 Intérêts de la quantification
Reproductibilité intra et inter-essai ADN CMV copies/réaction CV intra essai (%) CV inter essai (%) 102 103 104 105 1,9 0,5 0,6 0,9 1,8 1,0 0,7 1,7 15,4 12 12,2 11,5 49,6 32,7 23,7 21,3 Real time PCR Ils ont ensuite testé la reproduc intra et inter essai des deux techniques de PCR à partir d’ ADN CMV (AD169) purifié et contenant de (copies par réaction)10 2 à 10 5 Pour la PCR temps réel, les CV intra et inter sont < à 2% alorsq ue pour la technique cobas Cobas Amplicor Allice T et al (2006) JMV (78):

26 Intérêts de la quantification
23 transplantés de foie et 4 de rein Surveillance hebdomadaire Objectif : valider une PCR temps réel (TaqMan) pour la quantification du CMV dans le plasma et corréler les résultats avec l’antigénémie et la PCR plasmatique (Amplicor Monitor) La même étude a été réalisée dans le compartiment plasmatique et a montré une bonne corrélation entre l’antigénémie, la PCR cobas amplicor et la PCR temps réel voici une autre étude qui avait le même objectif : valiser une PCR quantitative en TR dans le management des infections à CMV L’étude repose sur 27 TO La différence avec l’étude précédente : les deux technoques de PCR sont réalisées dans le plasma Le seuil d’agpp était de 1 cellule pour 50000 Anicorps biotest pour agPP65 (+ si 1 cellule/50000) PCR moni amplicor PCR temps réel : extraction magna pure sur 200 µl de plasma; gène cible pp65 , contrôle externe plasmide avec gène pp65 Sur 27 patients : 19 ont une ag+ et ADN + Sur 19 : 13 développent une M à CMV et sont trt par GCV IV pdt 2 semaines Piiparinen et al, JCM 30 (2004)

27 R= 0,84 P< 0,0001 R= 0,80 P< 0,0001 R= 0,71 P< 0,0001
Piiparinen et al, JCM 30 (2004) Comme précédemment, les auteurs mettent en évidence une bonne corrélation Entre les 3 techniques

28 Intérêts de la quantification
Messages PCR quantitative en temps réel adaptée pour la quantification du CMV Bonne corrélation avec l’antigénémie et la PCR conventionnelle Meilleure performance technique : linéarité, seuil de détection et reproductibilité Mais Cobas donne un résultat + si HHV6 donc cobas n’est pas le test le plus adapté chez les transplantés qui réactivent souvent leur HHV6

29 LIMITES DE LA QUANTIFICATION

30 Limites de la quantification
Absence de standardisation des méthodes de quantification du CMV rend difficile l’adoption d’une valeur seuil de l’antigénémie ou de la charge virale Pour le diagnostic de la maladie à CMV Pour prédire le risque de maladie à CMV Hétérogénéité des populations de patients (type de greffe, statut CMV du couple D/R, effectif variable …) Origine du prélèvement (sang total, leucocyte, plasma) sur les populations de patients (type de greffe, statut CMV du couple D/R, type de surveillance virologique, traitement immunosuppresseur…) Valeur seuil de l’antigénémie ou de la charge virale Pour prédire une maladie à CMV Pour prouver une infection active pour initier un traitement antiviral Très variable selon les auteurs

31 Quel seuil de l’antigénémie pp65 ?
Seuil de l’antigénémie pp65 pour prédire le risque de maladie à CMV Boeckh et al, Clin Microbiol Rev, , 1998 Type de greffe Seuil Agpp65 Nombre patients Prévalence maladie à CMV (%) VPP (%) VPN (%) Référence Rein, coeur, foie  10 positive /105leucocytes 73 30 42 76 Bernabeu-Wittel et al, JID 2005 Moelle osseuse Dès la positivité 33 27 53 91 Boeckh et al, Blood, 1992 1 cellule + par lame 75 72 rein 130 17 41 100 Van der Berg et al, Transplantation,1989 >1 cellule + pour leuco > 10 cellules + pour leuco 69 96 >100 cellules + pour leuco 88 Ce tableau montre que en fonction du type greffe et du seuil d’agpp65 choisi, la VPP et VPN de l’antigénémie pp65 pour prédire la maladie à CMV vont varier Seuil de l’antigénémie pp65 pour le diagnostic de la maladie à CMV Très variable selon les auteurs MO (Boeckh et al, Blood 1992, 1994 Concernant le valeur de l’ag dans la prédiction de la M à CMV ; les valeurs de la S et la VPP de l’ag pour la prédiction de la M à CMV varient en fonction du seuil de l’ag choisi

32 Quel seuil de l’antigénémie pp65 ?
Seuil de l’antigénémie pp65 pour initier un traitement anticipé Chez les transplantés d’organe solide :  10 cellules positives / 2 x 105 leucocytes Chez les transplantés de moelle osseuse  cellules positives / 2 x 105 leucocytes Hallwachs et al. 1993; Locatelli et al. 1994

33 Quel seuil de l’antigénémie pp65 ?
Seuil de l’antigénémie pp65 pour initier un traitement anticipé Chez les transplantés d’organe solide  10 cellules positives / 2 x 105 leucocytes (rein) 100 cellules positives / 2 x 105 leucocytes (foie et coeur) Chez les transplantés d’organe solide séronégatifs pour le CMV et de moelle osseuse  cellules positives / 2 x 105 leucocytes D’autres seuils ont été décrits En fonction du type de greffe Et du statut séro vis à vis du CMV  10 cellules positives / 2 x 105 leucocytes chez les transplantés de rein 100 cellules positives / 2 x 105 leucocytes chez les transplantés de foie et de coeur Boeckh et al., Blood 1996, Boeckh et al, ClinMicrobiol rev, 1998

34 Quel seuil de virémie ? Seuil de virémie pour prédire le risque de maladie à CMV Seuil de virémie pour initier un traitement anticipé  Pas de consensus Type de greffe Seuil virémie Nombre patients Référence Foie 105 copies ADN /ml de sang total 162  Risque de maladie à CMV 162 Cope et al, JID 1997 Cœur 4 log 10 copies/ 106 leucocytes 73 73 V. Ghisetti et al. JMV (2004 Moelle osseuse >104 copies ADN/ml plasma 117 Zaia et al, JID, 1997 >104 copies ADN/ml sang total 110 RR = 6,46 (95% IC1,5-27,4 Gor et al, BMT 1998 Concernant le seuil de virémie associé à risque de maladie à CMV, les études montrent une varaition importante de ces valeurs seuils en fonction du type de greffe, de la méthode de quantification utilisée, du compartiment sanguin dans lequel a été réalisé la quantification Il est difficile de pouvoir les comparer entre eux Très variable selon les auteurs MO (Boeckh et al, Blood 1992, 1994 Boeckh et al, Clin Microbiol Rev, , 1998

35 Quel compartiment du sang ?
Détection du CMV plus précoce dans les PBL par rapport au plasma il n’y a pas encore de consensus sur le compartiment du sang dans lequel est préconisé la quantification du CMV De nombreuses études ont montré que les test leuco avaient une meilleure VPN pour prédire une maladie à CMV par rapport aux test plasma , les test leuco permettaient de détecter plus précocément uune infction à CMV par rapport aux autres tests Les résultats sont controversés pour la quantification entre sang total et plasma Pellegrin et al., J Infect Dis 2000

36 Quel compartiment du sang ?
Charge virale CMV sur sang total plus élevée (0,67 log) que sur plasma (p=0.0009) Charge virale CMV comparable dans les PBL et les PBMC Pas de différence significative de la baisse de la CV après traitement par du GCV parentéral entre SangTotal/plasma ou PBL/PBMC Sang total = compartiment de choix Concernant les uatres compartiments du sang, Une étude réalisée sur 319 échantillons provenant de 17 transplantés d’organe Quantification du CMV sang total, plasma, leuco, cellules mono Background. The quantitation of cytomegalovirus (CMV) DNA is a cornerstone in the management of CMV disease in transplant recipients. However, a consensus as to what is the optimal blood compartment for the detection and quantitation of CMV DNA in peripheral blood is nonexistent. Methods. With an automated quantitative assay, we have simultaneously quantified the CMV DNA load in whole blood (WB), plasma (PL), peripheral blood leukocytes (PBL), and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in 319 samples from 17 transplant recipients with 19 episodes of CMV disease that were treated with 2 weeks of intravenous ganciclovir. Results. Higher levels of CMV DNA were observed in WB than PL (PL minus WB mean difference, 0.67 log; 95% confidence interval, to -0.32;P =0.0009). This observation was most evident before treatment with intravenous ganciclovir (pretreatment geometric mean CMV DNA was 45,412 copies per ml of WB vs. 14,995 copies per ml of PL). In contrast, the CMV DNA levels between PBL and PBMC were highly comparable throughout the course of CMV disease and its treatment. Intravenous ganciclovir exerted a uniform effect on the four blood compartments with no statistically significant difference in the degree and rate of CMV DNA decline between WB and PL and between PBL and PBMC. Conclusions. Although our study demonstrates the adequacy of all blood compartments for CMV DNA quantification, the higher sensitivity of WB and its yield of higher CMV DNA render it an optimal sample for monitoring CMV DNA load during CMV disease in immunocompromised patients. Razonable et al, Transplant (2002) 73:968-73 Gerna et al, Herpes (2006)13:1 Guarrigue et al, JCM (2006) 36: 72-75

37 Conclusion Méthodes de quantification du CMV : outils diagnostiques multiples Le choix de la méthode dépend de la question posée Chez le patient immunodéprimé Dépister une infection active avant l’apparition de tout signe clinique Apporter la preuve d’une maladie à CMV L’utilisation de ces outils diagnostiques dépend de la question posée

38 Conclusions Antigénémie pp65 :
Méthode sensible pour évaluer la charge virale du CMV dans le sang Adapté pour les laboratoires de petite taille et/ou pour un faible nombre d’antigénémie Inconvénients Délai de traitement rapide de l’échantillon Technique manuelle, lecture subjective Faux négatif en cas de neutropénie

39 Conclusions ADN viral du CMV par PCR
Meilleure stabilité du génome viral par rapport à l’agpp65  prélèvement moins sensible au transport et possibilité de conservation du prélèvement Adapté pour les grandes séries Meilleure sensibilité des tests leucocytaires pour le diagnostic et la prédiction de la maladie à CMV Sang total adapté au diagnostic de routine et dans le suivi thérapeutique Moins sensible au transport et possibilité de conservation du prélèvement sans modification de la charge virale

40 Conclusions Apport incontestable de la PCR quantitative en temps réel/ PCR conventionnelle Évaluation plus précise de la cinétique de la réplication virale Amélioration des performances techniques des tests utilisés Automatisation Possibilité de standardiser des protocoles de PCR Notamment pour les CV faibles à modérée Délai de rendu plus rapide des résultats (3h pour real time et 6h pour Cobas) CMV PCR real time Sensibilité haute 10 copies/ml 1000 copies/ml de plasma Détectable avant pp65 Détection plus précoce de l’ADN du CMV par PCR dans les leucocytes Avantage pour détecter des petites quantités de génome viral précocément Ne nécessite que peu d’échantillon qui peut être congélé sans diminuer la quantité de virus (pp65 prélever fraichement et pas de congélation possible)

41 Perspectives Nécessité de standardiser les méthodes moléculaires de quantification sanguine du CMV Nécessité de valider un seuil pour chaque méthode quantitative et pour chaque indication (diagnostic et instauration d’un traitement anticipé) Nécessité de mettre en place d’un standard international de quantification du CMV  comparer les études utilisant des méthodes moléculaires très différentes

42 Démarche diagnostique
Bilan pré-greffe Statut sérologique du donneur et du receveur greffe Surveillance hebdomadaire Antigénémie ADNémie ARNémie Positif négatif Traitement anticipé Risque de maladie À CMV faible ou nul Surveillance des marqueurs d’infection active sous traitement

43 FIN

44 Pathogénicité Fonction du statut immunitaire
Infections peu ou pas symptomatiques chez le sujet sain Infections sévères chez les patients immunodéprimés Receveurs d’allogreffe de moelle ou d’organe Patients infectés par le VIH Les manifestations cliniques de l’infection à CMV qu’il s’agisse d’infections I ou II dépendent étroitement de l’état immunitaire de l’hôte Les infections a CMVH mettent en jeu le pronostic vital et fonctionnel chez les patients immunodéprimés comme Receveurs d’allogreffe Patients infectés par le VIH à un stade d’immunodépression sévère -Le caractère ubiquitaire du virus, la fréquence des réactivations virales favorisées par l’immunodepression cellulaire, ses interactions avec le CMH font du CMV un agent infectieux majeur après allogreffe de moelle ou d’organe Elle constitue la 1ère

45 Pathogénicité Infection à CMV Maladie à CMV Patient asymptomatique
Signes biologiques d’infection active à CMV Maladie à CMV Syndrome CMV : fièvre et leucopénie et/ou thrombopénie et/ou lymphocytose atypique et/ou élévation des transaminases CMV invasif Dysfonction d’un organe Et localisation viscérale Chez les receveur d’allogreffe, on distingue 2 tableaux cliniques _ l’infection à CMV chez le patients AS mais qui présentent des signes biologiques d’infection active La M à CMV : chez les patients symptomatiques avec ou non une atteinte organique Paya et al, AJT 2004

46 Facteurs de risque et maladie à CMV
Statut sérologique Donneur/Receveur (D/R) D+/R- : primoinfection Risque d’infection : 100% Risque de maladie : 85% (sans traitement) D-R+ : réactivation Risque d’infection : % Risque de maladie : 20% D-R+ : réinfection Risque de maladie : 20-40% Concernant le satut sérologique du couple D/R, les receveurs séroneg qui reçoivent un greffon d’un donneur séropos sont les pls à risque de développer une infection à CMV avec un risque de M à CMV établi à 85% Les receveurs séropos ont un risque de développer soit une réactivation de leur souche endogène soit une réinfection avec une souche exogène, mais dans tous les cas le risque de M à CMV est moindre

47 Facteurs de risque et maladie à CMV
Immunodépression Maladie à CMV entre le 1er et le 4ème mois après la greffe au moment où l’immunodépression est la plus forte Type de greffe Organe transplanté Risque de maladie sans traitement Rein, cœur, foie 8-35% Pancréas, rein-pancréas 50% Poumon, cœur-poumon 70-80% Un certain nombre d’études ont montré que le risque de M à CMV surveint entre le 1er et le 4ème mois qui suit la greffe Et que ce risque varie en fonction du type de l’organe greffé

48 Méthodes de quantification du CMV
Antigénémie pp65 Non moléculaires Moléculaires PCR conventionnelle : Amplicor Monitor (COBAS, Roche) PCR temps réel : Techniques maison +++ Trousses commercialisées (Argène Biosoft, Qiagen, Abbott….) NASBA : Trousse Nuclisens pp67 test (Organon tecknika) Biomérieux Hybridation moléculaire Hybrid Capture DNA Assay (Digene) Moléculaires Les méthodes non moléculaires de quantification du CMV reposent sur la virémie et l’agPP65 Parmi les méthodes moléculaires de quantification du CMV, différentes technologies ont été développées amplification de l’ADN viral avec détection des amplicons en point final : Amplification de l’ADN viral par des techniques de PCR temps réel (De nombreux protocoles maisons ainsi s=que des trousses commercialisées sont disponibles) - détection des transcrits ARNm très précoce ou tardif (pp67 (pUL65) par NASBA Détection de l’ADN viral par hybridation moléculaire

49 Méthodes de quantification du CMV
Méthodes moléculaires PCR conventionnelle : Amplicor Monitor (COBAS, Roche) PCR temps réel : Techniques maison +++ Trousses commercialisées (Argène Biosoft, Qiagen, Abbott….) NASBA : Trousse Nuclisens pp67 test (Organon tecknika) Hybridation moléculaire Hybrid Capture DNA Assay (Digene) Les méthodes non moléculaires de quantification du CMV reposent sur la virémie et l’agPP65 Parmi les méthodes moléculaires de quantification du CMV, différentes technologies ont été développées amplification de l’ADN viral avec détection des amplicons en point final : Amplification de l’ADN viral par des techniques de PCR temps réel (De nombreux protocoles maisons ainsi s=que des trousses commercialisées sont disponibles) - détection des transcrits ARNm très précoce ou tardif (pp67 (pUL65) par NASBA Détection de l’ADN viral par hybridation moléculaire PCR = Polymerase chain reaction NASBA = Nucleic acid sequence-based amplification

50 Limites de la quantification
Valeurs des tests par rapport au diagnostic de la maladie à CMV : grandes variations Voici un tableau qui récapitule les valeurs de S et de Sp pour l’ag et la PCR pour le diagnostic de la M à CMV Il existe une grande variation dans les %

51 Marqueurs sanguin d’infection active
Prélèvement Fraction méthodes Expression des résultats Virémie Sang hépariné (10ml) Leucocyte (L) Culture classique ou rapide Nb de cellules infectées/ 106 L Antigénémie (Agpp65) Sang hépariné ou EDTA (5ml) leucocyte Immunofluores-cence Nb noyaux +/ 2x105 L ADNémie leucocytaire Sang EDTA ou citrate (5ml) PCR Nb copies /ml Plasmatique ou sérique Sang EDTA ou sec (5ml) Plasma sérum ARNémie Indifférent (0,2ml) Sang total NASBA Phosphoprotéine UL83 : ppUL83 ou pp65

52 Méthodes de quantification du CMV
Méthodes non moléculaires Méthodes Avantages Inconvénients Virémie par Culture Isolement viral Etude de la résistance Long (1 à 6 semaines) , fastidieux, Equipement spécifique, faible sensibilité, risque de contamination bactérienne ou fungique, acheminement rapide au laboratoire Culture rapide Rapide (48 heures) Equipement spécifique, faible sensibilité, toxicité cellulaire, acheminement rapide au laboratoire Antigénémie pp65 Rapide (5 à 6 heures), standardisée acheminement rapide au laboratoire, faux négatif si neutropénie Parmi les méthodes non moléculaires de quantification du CMV, la recherche d’un virémie en culture classique ou rapide ne sont pas recommandées pour la quantification du viruus. Elles ont une sensibilité plus faible que l’agPP65 En revanche, l’agpp65 présente l’avantage d’une méthode rapide, l’existence de trousses commercialisées standardisées mais le prélèvement doit être rapidement acheminé au labo Processing time < 6 heures Expérience pour la technique

53 Intérêts de la quantification
Le diagramme vous présente les valeurs maximales et médianes des taux d’agpp65 au cours du suivi longitudinal des patients : vous pouvez noter que le plus fort taux agpp65 a été obtenu à la 6ème semaine après la greffe Bernabeu-Wittel et al, JID 2005

54 Intérêts de la quantification
Messages PP65, Cobas et TaqMan : équivalentes pour la quantification du CMV Avantage de la PCR temps réel : Meilleure sensibilité (250 contre 400 copies/ml) Meilleure reproductibilité intra-essai (1% contre 12% pour cobas) et inter-essai (2% contre 30%) Gamme de linéarité étendue (250 à 25 millions de copies/ml) Adapté pour les grandes séries

55 Quel compartiment du sang ?
409 échantillons (transplantés d’organe et de moelle osseuse) Plasma : nombreux avantages (facilité de prélèvement, de conservation…) Validation of Clinical Application of Cytomegalovirus Plasma DNA Load Measurement and Definition of Treatment Criteria by Analysis of Correlation to Antigen Detection Successful preemptive cytomegalovirus (CMV) therapy in transplant patients depends on the availability of sensitive, specific, and timely diagnostic tests for CMV infections. The pp65 antigenemia assay has been used for this purpose with considerable success. Quantification of CMV DNA is currently regarded to be an alternative diagnostic approach. The precise relationship between these two methods has still to be defined, but is essential to compare diagnostic results. This study compared the results of both assays with a large series of transplant recipients in different categories. An internally controlled quantitative real-time CMV DNA PCR was used to test 409 plasma samples from solid organ transplant (SOT) and stem cell transplant (SCT) patients. Levels of CMV DNA in plasma correlated well with classified outcomes of the pp65 antigenemia test. Despite this correlation, the quantitative CMV PCR values in a class of antigen test results were within a wide range, and the definition of an optimal cutoff value for initiating treatment required further analysis by a receiver-operating characteristic curve analysis. This is essential for reactivating infections in particular. For the SCT patients the optimal cutoff value of CMV DNA load defining relevant viral reactivation (in this assay, 10,000 copies/ml) was slightly higher than that for the SOT patients (6,300 copies/ml). Based on a comparison with the established pp65 antigenemia assay, quantification of CMV DNA in plasma appeared to be capable of guiding the clinical management of transplant recipients. This approach may have important advantages, which include a superior reproducibility and sensitivity, allowing the inclusion of kinetic criteria in clinical guidelines. JS. Kalpoe, J. Clin Microbiol (4):

56 Pathogénicité Fonction du statut immunitaire de l’hôte
Receveurs d’allogreffe de moelle ou d’organe Infection à CMV : Patient asymptomatique Signes biologiques d’infection active à CMV Maladie à CMV Patient symptomatique (fièvre…) Et/ou localisation viscérale Les manifestations cliniques de l’infection à CMV qu’il s’agisse d’infections I ou II dépendent étroitement de l’état immunitaire de l’hôte Les infections a CMVH mettent en jeu le pronostic vital et fonctionnel chez les patients immunodéprimés comme Receveurs d’allogreffe Patients infectés par le VIH à un stade d’immunodépression sévère -Le caractère ubiquitaire du virus, la fréquence des réactivations virales favorisées par l’immunodepression cellulaire, ses interactions avec le CMH font du CMV un agent infectieux majeur après allogreffe de moelle ou d’organe Elle constitue la 1ère Paya et al, AJT 2004

57 Facteurs de risque et maladie à CMV
Facteurs de risque de survenue d’une maladie à CMV après greffe d’organe Statut sérologique CMV du couple Donneur/Receveur Présence des marqueurs d’infection active dans 85% Traitement immunosuppresseur Organe greffé …

58 Stratégies thérapeutiques
TRAITEMENT CURATIF Ganciclovir Valganciclovir Cidofovir Foscarnet TRAITEMENT PRÉVENTIF Ganciclovir Valganciclovir valaciclovir Les infections sévères chez les patients ID vont nécessiter l’administration d’un trt antiviral spécifique Traitement curatif : instauré en cas d’infection symptomatique à CMVH Une phase d’attaque de 2 à 3 semaines suivi d’une phase d’entretien pour prévenir les rechutes Traitement préventif : Essentiellement chez le receveur d’allogreffe infection symptomatique à CMVH receveur d’allogreffe

59 Stratégies thérapeutiques
Traitement préventif traitement prophylactique chez tout receveur profondément immunodéprimé à haut risque de développer une infection grave à CMVH 3 mois USA traitement anticipé ou preemptive : initié lors de la détection d’un marqueur biologique d’infection active en l’absence de symptômes cliniques Europe

60 Méthodes de quantification du CMV
Méthodes non moléculaires Méthodes Avantages Inconvénients Virémie par Culture Isolement viral Etude de la résistance Long (1 à 6 semaines) , fastidieux, Equipement spécifique, faible sensibilité, risque de contamination bactérienne ou fungique, acheminement rapide au laboratoire Culture rapide Rapide (48 heures) Equipement spécifique, faible sensibilité, toxicité cellulaire, acheminement rapide au laboratoire Antigénémie pp65 Rapide (5 à 6 heures), standardisée acheminement rapide au laboratoire, faux négatif si neutropénie Parmi les méthodes non moléculaires de quantification du CMV, la recherche d’un virémie en culture classique ou rapide ne sont pas recommandées pour la quantification du viruus. Elles ont une sensibilité plus faible que l’agPP65 En revanche, l’agpp65 présente l’avantage d’une méthode rapide, l’existence de trousses commercialisées standardisées mais le prélèvement doit être rapidement acheminé au labo Processing time < 6 heures Expérience pour la technique

61 Quel compartiment du sang ?
Gerna et al Herpes 13:1 2006 Sang total : compartiment de choix Guarrigue et al JCM 36 (2006) 72-75 Sang total et fraction leucocytaire : compartiments de choix Agpp65 + à 50 cellules  3,8 log 10 copies/ml de sang total 3,6 log 10 copies/ml sur sang total = seuil pour déterminer une infection active 50 agpp65 + corrélé à 3,8 log 10 copies/ml (Guarrigue I et al, JCM, 36(2006) ;) 4 log 10 copies/ml (Li et al 2003, Mengelle et al, 2003) 4,09 log 10 copies/ml (Gouarin et al, 2004)

62 Quel seuil de virémie? Seuil de virémie pour initier un traitement anticipé Chez les transplantés d’organe solide : 1000 à 5000 copies /ml de plasma (Cobas Amplicor) Chez les transplantés de moelle osseuse Dès la détection de l’ADN plasmatique

63 Quel seuil de virémie? Seuil de virémie pour initier un traitement anticipé Chez les transplantés d’organe solide : copies /ml de sang total Chez les transplantés de moelle osseuse copies /ml de sang total Analyse rétrospective de CV chez des patients qui ont initiés un trt anticipé sur la base d’une ag Plus 90% des patients trt ont CV > c:ml sang total 90% des patients non trt ont CV < c:ml sang total VPP de 90% chez TO Gerna et al Herpes 13:1 2006